肺癌又称原发性支气管肺癌,源于支气管黏膜上皮,是临床最常见的恶性肿瘤之一。2017年美国最新肿瘤统计表明,肺癌估计的死亡人数为:男性84590例,女性71280例,分别占各类肿瘤死亡的27%和25%,位居各类肿瘤死亡之首。根据生物学特性,肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。前者约占肺癌的15%～20%,后者约占肺癌的80%～85%。目前肺癌的治疗包括手术切除、以铂类(如顺铂或卡铂)为基础的联合化疗、放疗以及靶向药物治疗等,但临床疗效仍不理想,5年生存率不超过15%,其主要原因是肺癌细胞的发生、发展尚不完全清楚。因此,探索肺癌发生、发展过程中新的关键分子,对明确肺癌发生的分子机制以及以此为靶点进行靶向治疗具有重要意义,有助于提高肺癌患者的生存率,改善其生存质量。转化生长因子 β 调节子 4(Transforming growth factor beta regulator 4,TBRG4),又称含Fas激活的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域蛋白4(Fas-actived serine/threonine kinase domain-containing protein 4,FASTKD4)或细胞周期进程修复蛋白 2(cell cycle progression restoration protein 2,CPR2)。TBRG4基因位于 7p14-p13,编码转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFp)的调节子。已有研究表明,TBRG4参与了对细胞周期素CLN1和CLN2的转录并维持其稳定性。亲和标记和纯化质谱发现,人HEK293和Jurkat细胞株中TBRG4与人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HTV)编码的病毒蛋白U(virus proteinU,Vpu)相互作用。TBRG4也与多效生长因子(pleiotrophin,PTN)相互作用。TBRG4沉默后影响了线粒体mRNAs的稳定性。TBRG4表达异常也与肿瘤有关。塞扎莱综合征(Sezary Syndrome)是一种皮肤T细胞淋巴瘤白血病,研究发现塞扎莱综合征患者的TBRGR基因区域存在异常复制。约30%来源于头颈部鳞状细胞癌患者细胞系的该区域存在异常扩增现象。此外,TBRG4在多发性骨髓瘤患者的髓外复发组织中表达明显异常。TBRG4蛋白在正常乳腺细胞系16N中低表达,而在乳腺癌原位细胞系NT与转移型细胞系MTZ中表达均升高,且其在乳腺癌中的表达与乳腺癌的恶性程度正相关。TBRG4敲减显著影响乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231及T47D的生长,且明显降低了上述3株细胞的增殖能力。此外,TBRG4敲减也促进了细胞凋亡并抑制了细胞克隆形成能力,但对乳腺癌细胞的侵袭能力影响不大。而该基因在肺癌中的功能尚不清楚。鉴于此,本课题拟探究TBRG4在肺癌细胞增殖、凋亡中的功能及可能的分子机制。[目的]1.分析TBRG4在NSCLC中的表达及其临床意义;2.明确TBRG4在肺癌细胞增殖、凋亡中的作用;3.探讨TBRG4在促进肺癌细胞增殖中的分子机理。[方法]1.收集75例非小细胞肺癌患者临床样本,包括肿瘤组织和癌旁组织;临床资料包括性别、年龄、组织病理学分级、肿瘤大小以及TNM分期等;免疫组化方法检测TBRG4在NSCLC患者肺癌组织和癌旁组织中的表达;根据免疫组化结果对细胞染色强度和细胞染色阳性率进行评分,将"染色强度评分"和"染色阳性率评分"的乘积作为总评分来评价TBRG4的表达,评判标准为:(1)0～1分为低表达;(2)≥2分为高表达。免疫组化数据结合临床资料数据,采用Mann-Whitney U检验进行统计检验,分析TBRG4的表达与上述指标的相关性,评价TBRG4表达的临床意义。2.首先,用荧光定量PCR(qPCR)方法检测TBRG4基因在4种肺癌细胞株H1299、H1688、H1975和A549中的表达水平;其次,根据NCBI公共数据库公布的TBRG4基因核苷酸序列进行生物信息学方法分析,确定TBRG4基因的特异性干扰片段,以GV115慢病毒为载体构建TBRG4基因特异性慢病毒干扰载体(shTBRG4)和对应的对照干扰载体(shCtrl);上述两种干扰载体分别转染293T细胞,qPCR和Western blot确定TBRG4敲减效率;然后,用慢病毒干扰载体shCtrl和shTBRG4分别转染H1299细胞,Celigo法检测H1299细胞连续5天的生长情况,分析TBRG4基因敲减对H1299细胞生长的影响;MTT法检测细胞连续5天的活力情况,分析TBRG4基因敲减对H1299细胞增殖的影响;分别用AnnexinV-APC单染色试剂盒和碘化丙啶染色shCtrl和shTBRG4慢病毒载体转染的H1299细胞,流式细胞术检测处于凋亡早期的凋亡细胞数目,分析TBRG4基因敲减对H1299细胞凋亡的影响;流式细胞术检测细胞内DNA的含量,分析处于G0/G1、S和G2/M期细胞的比例,分析TBRG4基因敲减对细胞周期的影响;将对数生长期的shCtrl和shTBRG4慢病毒干扰载体感染的H1299细胞接种6孔培养板,培养14天,4%多聚甲醛固定细胞30～60min,Giemsa染液染细胞10～20mini,光镜下进行克隆计数,检测TBRG4基因敲减对H1299细胞克隆形成的影响;最后,将对数生长期的shCtrl和shTBRG4慢病毒转染的H1299细胞(5×106个)接种于BALB/c裸鼠右侧腋下中部外侧皮下,15天后开始测定瘤体的长、宽、高,每周2次,计算瘤体体积。5周后处死裸鼠,完整剥离移植瘤并称重,分析TBRG4敲减对成瘤能力的影响。3.Trizol一步法提取shCtrl和shTBRG4慢病毒干扰载体转染的H1299总RNA,质量检测后用GeneChip 3’IVT Express Kit制备amplified RNA(aRNA),并对aRNA进行片段化、标记和芯片杂交;Affymetrix Genechip Operating Software Version 1.4提取芯片数据,比较shCtrl组和shTBRG4组数据,筛选差异倍数为1.5的差异基因,IPA在线分析TBRG4基因敲减后其上、下游基因的改变,并通过qPCR和Western blot方法鉴定其中的部分关键基因的表达。[结果]1.分析TBRG4在NSCLC患者癌组织和癌旁组织支气管黏膜上皮细胞胞浆和胞核的表达检测结果表明:TBRG4在癌细胞的胞浆中主要呈高表达,而在癌旁细胞的胞浆中则呈低表达,且TBRG4在胞浆中的表达高低与患者性别、年龄以及组织病理学分级无关(P均>0.05);随着瘤体增大、TNM分期越晚,TBRG4表达呈升高趋势,但没有统计学差异(P均>0.05);TBRG4在癌细胞的胞核中主要呈高表达,而在癌旁细胞的胞核中则呈低表达,且TBRG4在胞核中的表达高低与患者性别、年龄以及组织病理学分级也无关(P均>0.05);随着瘤体增大、TNM分期越晚,TBRG4表达呈升高趋势,也没有统计学差异(P均>0.05)。TBRG4在癌组织和癌旁组织的表达分析结果表明,TBRG4在癌组织中的阳性表达率为84.00%,而在癌旁组织中的阳性表达率为22.67%;Mann-WhitneyU检验结果表明,TBRG4在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(χ2 = 57.09,P<0.01)。病理结果证实TBRG4蛋白在癌组织中表达升高。2.qPCR结果表明,TBRG4在肺癌细胞H1299和A549中高表达,而在H1688和H1975细胞中低表达;PCR和测序结果表明,TBRG4特异性干扰片段已成功插入到GV115载体;shCtrl和shTBRG4干扰载体转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测HEK293细胞的生长情况发现,两种干扰载体转染对HEK293细胞的正常生长无影响。qPCR检测结果表明,相对于shCtrl组,shTBRG4组中TBRG4mRNA的表达显著下降(P<0.01),其敲减效率为84.4%。Western blot结果证实,shTBRG4转染的细胞其TBRG4蛋白的表达显著低于shCtrl组。Celigo计数法结果表明,与shCtrl组相比,shTBRG4组细胞增殖明显被抑制(P<0.01),尤其是第4天和第5天,细胞增殖分别为1.45倍和1.75倍,而shCtrl组则分别为3.70倍和5.77倍,以上结果表明TBRG4敲减抑制了 H1299细胞的增殖。流式细胞术检测结果表明,相对于shCtrl组,shTBRG4组中G0/G1期的细胞百分比明显升高(P<0.01),而S期和G2/M期的细胞百分比则明显下降(分别为P<0.05和P<0.01),上述结果表明,TBRG4敲减导致H1299细胞的细胞周期停滞于G0/G1期。流式细胞术检测H1299细胞早期凋亡结果表明,与shCtrl组相比,shTBRG4组的早期凋亡细胞百分比显著增加(P<0.01)。Giemsa染色检测shTBRG4转染H1299细胞的克隆形成数量结果表明,shCtrl组和shTBRG4组的细胞克隆形成数量分别为32 ±2和9 ±2个;与shCtrl组相比,shTBRG4组的细胞克隆形成数量显著下降(P<0.01),说明TBRG4敲减明显抑制了H1299细胞的克隆形成能力。MTT法检测结果表明,与shCtrl组相比,shTBRG4组第4天和第5天细胞活力显著下降(P均<0.01),说明TBRG4敲减导致H1299细胞增殖明显下降。裸鼠皮下注射慢病毒转染的H1299细胞并观察TBRG4对成瘤能力影响的结果显示,与shCtrl组相比,shTBRG4组的移植瘤重量明显降低(P<0.05);而裸鼠活体成像系统数据显示,shTBRG4组大鼠的区域内总荧光表达量亦显著低于shCtrl组(4.0E+10[p/s]/[μW/cm2]vs 1.50E+11[p/s]/[μW/cm2])(P<0.01)。3.基因芯片数据分析结果表明,以shCtrl组相比,shTBRG4组基因差异倍数大于1.5的基因共有586个,其中229个基因上调,357个基因下调。IPA对差异基因进行经典信号通路分析结果表明,G Beta Gamma Signaling显著被抑制,且其涉及到的差异基因的表达趋势与本研究检测到的表达趋势一致。对差异基因中的上游调控因子分析结果显示,PTEN明显被激活,并导致下游基因如RAP1A、IGF2等激活,而HIF1A、MYBL2、SERPINE1、AURKA、CDC20以及FOXM1 等基因表达下调。差异基因的疾病和功能分析结果表明,cellviabilityof tumor cell lines功能明显被抑制,并导致FYN、IGF2等激活,而RRM2、AURKA、CAV1、HIF1A、SCD、FOXM1等基因则被抑制。对上下游调控因子和基因间的调控关系分析发现,TBRG4敲减引起上游调控因子FOXM1、Nfat、PE400被抑制,进而抑制了如CAV1、SERPINE1、CDC20、MYBL2、E2F2等下游基因,从而激活了organismal death功能,并对S phase起抑制作用。随后,对差异基因进行疾病和功能网络分析发现,差异基因主要落入25类疾病和功能网络,其中排名最靠前的两类疾病和功能网络分别是Infectious Diseases,Cancer,Organnismal Injury and Abnormalities和Cell Cycle,Embryonic Development,Canncer。综合上述生物信息学结果,构建了TBRG4基因与 14个差异基因(CDC20、DDIT3、FOXM1、IDI1、PGK1、RRM2、SCD、SERPINE1、SESN2、RAP1A、CAV1、AURKA、IGF2和MYBL2)的调节网络。qPCR分析结果表明,TBRG4敲减下调了CDC20、FOXM1、IDI1、PGK1、RRM2、SCD、SERPINE1、RAP1A、CAV1 和AURKA的表达,而上调了DDIT3、IGF2和SESN2的表达,该结果与IPA分析的TBRG4敲减参与的网络调节结果相一致。Western blot检测结果证实,TBRG4敲减后CAV1和RRM2蛋白表达降低,而DDIT3蛋白表达升高。[结论]1.TBRG4在NSCLC患者癌组织中的表达明显高于癌旁组织。临床资料的相关性分析表明,TBRG4的表达高低与性别、年龄、病理分级、肿瘤大小以及TNM分期无关。需要更多的临床病例进一步验证。2.TBRG4敲减显著抑制了肺癌细胞H1299的增殖和克隆形成,促进了其凋亡,导致细胞周期停滞于G0/G1期,减缓了异种移植瘤的生长。3.TBRG4敲减抑制H1299细胞增殖,可能通过下调CAV1和RRM2、上调DDIT3实现的。