论文部分内容阅读
冠蚌(Cristaria plicata)分别是我国重要的海水和淡水珍珠生产物种,对比分析由环境差异而导致的矿化和免疫机制的异同,可以丰富相关领域的基础研究资料,也可为珍珠生产提供理论指导。本实验利用Illumina Hiseq平台构建了两种淡水蚌的外套膜转录组文库,结合马氏珠母贝已有的外套膜转录组和全基因组数据库,对比分析与贝类矿化和免疫机制相关的基因,并筛选部分高表达基因进行定量验证,克隆和功能分析。主要结果如下:(1)三角帆蚌和褶纹冠蚌矿化和免疫相关基因的转录组分析:利用外套膜转录组测序数据,在三角帆蚌中组装并去冗余后得到47,722个Unigenes;在褶纹冠蚌中得到66,072个Unigenes。利用马氏珠母贝已经确定的外套膜差异表达的矿化基因集,筛选三角帆蚌和褶纹冠蚌中的同源基因,其中包括含有VWA结构域的蛋白(VWA-containing protein)、几丁质酶(chitinase)、几丁质合成酶(chitin synthase)、酪氨酸酶(tyrosinase)等。结果显示,三角帆蚌中相关的差异表达unigenes有85个,在褶纹冠蚌中有 119 个(|log2FoldChange (RMO/RMC) |≧2, FDR≦0.05)。筛选出与免疫相关的差异表达基因有 Histone H3、Histone H4、Histone acetyltransferase(HAT)和 Histonedeacetylase (HDAC) (|log2FoldChange (RMO/RMC) |≧2, FDR≦0.05)。并对三个物种中 VWA-containing protein、chitin synthase 和 tyrosinase 基因的各 2 条序列进行表达量验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组数据相一致。(2)三个物种外套膜矿化相关差异表达基因和通路筛选及验证:根据|log2FoldChange (RMO/RMC) |≧5, Pvalue≦0.05, FDR≦0.05 的标准筛选三个物种边缘膜和中央膜的高表达基因。其中,边缘膜高表达基因马氏珠母贝中有91个,三角帆蚌中有286个,褶纹冠蚌中有165个;中央膜高表达基因马氏珠母贝中有20个,三角帆蚌中有43个,褶纹冠蚌中有84个。本文选取wingless-type MMTV integration site family, member 7 (Wnt)和Mucin基因进行表达验证,结果显示荧光定量PCR结果与转录组结果一致。对三个物种外套膜差异表达基因分别进行KEGG通路富集分析,比较后筛选出Hedgehog signaling pathway (Pvalue≦0.01)为主要研究对象,马氏珠母贝中参与此通路的基因有25个,三角帆蚌中有25个,褶纹冠蚌中有26个,对hedgehog interacting protein进行荧光定量验证,基因表达趋势与转录组相吻合。(3)三个物种外套膜免疫相关差异表达基因的克隆及功能验证:筛选三个物种组蛋白及乙酰化修饰相关基因,利用RACE技术获得马氏珠母贝中PmH3、PmH4-1、PmH4-2、PmHAT、PmHDAC-1和PmHDAC-2的全长分别为627bp、556 bp、599bp、2025 bp、2143 bp、887 bp,各自编码氨基酸 136 个、115 个、113 个、491 个、479个、154个;三角帆蚌和褶纹冠蚌中未克隆出完整基因序列。利用LPS刺激后,PmH3、PmH4-2、PmHAT、PmHDAC-1和PmHDAC12的相对表达量都发生显著变化,其中PmH3、PmH4-2、PmHAT的相对表达量和酶活力在刺激后12小时出现显著上升趋势(P<0.05),和PmHDAC-1和PmHDAC-2在刺激后6小时就出现了显著上升趋势(P<0.05),而PmH4-1的相对表达量不显著,这些实验结果可以初步推测PmH3、PmH4-2、PmHAT、PmHDAC-1和PmHDAC-2与机体的免疫反应息息相关。