论文部分内容阅读
背景:家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolaemia FH）是常染色体显性遗传性疾病,（MIM:#143890）。主要临床特点是高水平的循环低密度脂蛋白,特征性黄瘤。导致动脉粥样硬化在生命早期快速发展,其中最为严重的是导致心血管动脉粥样硬化（ASCVD）的早发。基因突变引起家族性高胆固醇血症。编码低密度脂蛋白受体（LDLR）,载脂蛋白B（apoB）和枯草溶菌素转换酶-Kexin 9型（PCSK9）的基因缺陷导致低密度脂蛋白胆固醇从血浆中清除的效率减慢,是目前公认的3个导致家族性高胆固醇血症的基因。低密度脂蛋白受体（LDLR）,主要表达于肝细胞细胞膜表面,负责低密度脂蛋白颗粒（LDL）的摄取,从而从血浆中去除胆固醇,该基因的突变是导致家族性高胆固醇血症的最多见病因。在内质网合成120kDa的LDLR蛋白前体,经高尔基体进行糖基化后形成160kDa的成熟体后,转运到细胞膜表面发挥作用。LDLR蛋白共有5个功能域由不同外显子编码。从N端开始,分别为配体结合结构域,通过该区域与LDL配体相结合;接下来是EGF前体同源功能域,该区域被认为与PCSK9结合,与LDLR蛋白在溶酶体的降解有关;第3个是糖链结合域,该区域糖链生成后有利于LDLR蛋白的稳定性,使蛋白不容易降解;第4个区域为跨膜域,LDLR蛋白穿过细胞膜的部分;第5个区域为胞内段,与LDLR蛋白在细胞膜进入被膜小窝内内化相关。LDLR蛋白在细胞表面通过配体结合域与LDL结合,LDLR-LDL复合物在细胞表面通过网格蛋白包被的凹坑内吞作用进入细胞中。LDLR-LDL受体配体复合物颗粒随后在内体的低pH环境中释放,然后受体返回到细胞表面,该过程称为受体循环。根据突变的性质和突变在低密度脂蛋白受体基因内的位置以及对蛋白质的表型影响,突变分为5个不同的类别:1型:无低密度脂蛋白受体合成;2型:低密度脂蛋白受体在内质网内合成后运输到高尔基体再运输到细胞膜表面的过程存在缺陷;3型:低密度脂蛋白与低密度脂蛋白受体结合受损;4型:由于网格蛋白聚集不良,LDLR/LDL复合体不能内化;5型:LDLR/LDL复合物解离后,低密度脂蛋白受体循环回细胞膜时存在障碍。PCSK9是一种由肝脏分泌的丝氨酸蛋白酶。它在肝细胞膜外结合于LDLR蛋白。一旦PCSK9-LDLR复合体通过被膜小窝区域进入肝细胞内,LDLR蛋白就不能再循环回细胞表面,而是在细胞内进行分解。低密度脂蛋白受体受体的主要配体是低密度脂蛋白（LDL）。其含有单一拷贝载脂蛋白B-100;大约65-70%的血浆胆固醇以低密度脂蛋白的形式在血液内循环。杂合子的家族性高胆固醇血症患者（HeFH）低密度脂蛋白血浆浓度通常在5?13 mmol/L,而纯合子家族性高胆固醇血症患者（HoFH）的低密度脂蛋白水平远高于13 mmol/L。汇总19个调查共2,458,456个人的数据,发病率大约是1:250。纯合子FH发病率大约1:300,000（在1:160,000到1:1,000,000之间）。未经治疗的HeFH往往会在20岁或者较早的年龄经历第一次心血管事件。与一般人群相比早20多年。未治疗的纯合子家族性高胆固醇血症预后更差,许多患者在童年或青春期就会经历冠状动脉事件。在杂合子家族性高胆固醇血症药物治疗方面,高剂量他汀类药物是一线治疗。在最大耐受量的他汀类药物治疗患者中低密度脂蛋白水平降幅达不到50%的患者,建议加入其他降低低密度脂蛋白的药物。纯合子家族性高胆固醇血症的治疗需要更加专业与积极的药物降脂治疗,甚至需要选择血液透析治疗。目的:LDLR基因位于19号染色体的短臂上。包含18个外显子,内含子,和启动子区。到目前已有超过1300多种的LDLR基因突变被发现。然而之前的研究提示LDLR基因突变不一定能够导致FH的发生。因此,对于LDLR基因功能的验证是有必要的。我们选取了两个无血缘关系的FH家系,测序发现LDLR基因存在突变后,进一步在其表达和分布以及功能进行验证。方法:根据荷兰DLCNC（Dutch lipid clinic network criteria）评分诊断标准收集家族性高胆固醇血症家系。召集家系成员抽取空腹血,检测血脂。绘制家系图谱。送先证者血样进行全外显子捕获测序,比对与胆固醇代谢相关的基因,寻找突变位点。发现两个家系均存在LDLR基因的突变。家系1,因突变位点在16号外显子最后一位,可能导致RNA剪切改变,提取先证者全血总RNA,逆转录为cDNA并作为模板,根据LDLR基因的mRNA序列设计跨16号外显子的引物,PCR扩增,扩增产物凝胶电泳,将不同条带切胶、纯化、测序。家系2,由于不是单碱基改变,为明确是单个等位基因突变,还是两个等位基因都存在突变,我们设计LDLR基因突变周围引物,两端带有限制性内切酶序列,PCR扩增,将PCR产物连接至质粒,转化入细菌,挑出单克隆,提取质粒后送测序。为研究突变是否影响LDLR蛋白功能,构建携带野生型、与突变型LDLR基因的慢病毒载体,包装病毒并感染肝源性细胞HepG2,建立稳定过表达野生型及突变型LDLR基因的细胞系。采用生物素标记-亲和素纯化方法纯化细胞质膜蛋白,随即采用免疫印迹检测并比较分布于细胞质膜,及全细胞裂解液中的野生型与突变体LDLR蛋白。同时,采用免疫细胞荧光-激光共聚焦扫描方法,观察野生型与突变体LDLR蛋白的亚细胞分布。此外,将荧光物质DiI标记的LDL与细胞共孵育,通过激光共聚焦扫描、ImageJ软件分析细胞内DiI-LDL荧光强度,来分析野生型与突变体LDLR蛋白介导LDL摄取的能力。结果:家系1的先证者存在c.2389G>A突变,位于第16外显子的最后一位。进一步对mRNA的分析发现,该突变导致mRNA剪切改变,引起成熟mRNA中第16号外显子缺失。构建16号外显子缺失的突变型慢病毒质粒,包装病毒,感染HepG2细胞,检测蛋白质表达与分布,结果显示该突变几乎不能到达细胞质膜,主要在高尔基体蓄积。表达该突变体的HepG2细胞摄取DiI-LDL显著少于表达野生型的HepG2细胞。家系2的LDLR基因突变位于13外显子。通过PCR扩增,将产物连接到质粒的方式,分别分析两等位基因序列,我们发现该突变是位于一个等位基因的缺失-插入突变c.18851889 delins GATCATCAACC,导致629F（苯丙氨酸）630S（丝氨酸）被删除,取而代之的是D（天冬氨酸）H（组氨酸）Q（谷氨酰胺）P（脯氨酸）。该突变导致编码的蛋白质在细胞膜分布显著减少,并且分子量减少约40KD,其主要在内质网蓄积,表达该突变体的HepG2细胞摄取DiI-LDL显著少于表达野生型的HepG2细胞。结论:我们分别在两个高胆固醇血症家系中LDLR基因发现c.2389G>A突变和c.18851889 delins GATCATCAACC突变。前者导致mRNA剪切异常,引起成熟mRNA中16号外显子缺失,导致LDLR蛋白跨膜区截短,突变型LDLR蛋白不能到达细胞膜,介导LDL摄取的功能丧失。后者导致LDLR蛋白EGF-同源结构域中氨基酸序列改变,引起LDLR蛋白滞留于内质网内,在细胞膜上的分布显著减少,摄取LDL的能力下降。我们的研究结果提示,这两种突变均为高胆固醇血症的致病突变。