大豆MYB转录因子GmMYBJ1和GmMYBJ2的克隆与功能分析

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大豆是重要的粮食和经济作物,不仅为人类和家畜等提供了丰富的蛋白质,也是食用油的重要来源。然而随着社会的快速发展及受全球气候变化的影响,大豆的生长和发育越来越多的受到各种不良因子的影响,如:干旱、低温和土壤盐渍化及病害等,这给大豆的生产造成了巨大损失。已有研究表明,MYB转录因子参与了植物应对生物及非生物胁迫反应,在提高植物对逆境的适应性方面起着非常重要的作用。本研究从大豆品种吉林32中克隆了2个新的MYB转录因子,命名为GmMYBJ1和GmMYBJ2,并对它们进行了结构和功能初步分析,此研究进一步丰富了大豆MYB转录因子基因资源,也为其进一步应用提供理论基础,主要研究结果如下:1.利用RT-PCR技术从大豆品种吉林32中分离出两个新的MYB转录因子基因。其中,GmMYBJ1的开放阅读框为816bp,编码271个氨基酸;GmMYBJ2的开放阅读框为960bp,编码319个氨基酸。对两个基因编码的蛋白进行生物信息学分析,发现其均含有两个保守的MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB转录因子。2.利用重叠延伸PCR分别构建GmMYBJ1和GmMYBJ2的绿色荧光蛋白融合表达载体,通过农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位,结果表明两基因均定位于细胞核中,这与其作为转录因子发挥作用的事实是一致的。3.构建酵母表达载体pGBKT7-GmMYBJ1及pGBKT7-GmMYBJ2,转入酵母菌株AH109中,在营养缺陷型培养基中筛选阳性转化子。结果表明:GmMYBJ1在酵母中不具转录激活功能或激活功能微弱;而GmMYBJ2具有转录激活功能,且β-半乳糖苷酶显色反应呈现蓝色。4.利用real-time PCR对GmMYBJ1和GmMYBJ2在逆境诱导下的表达特性进行分析。结果表明:两基因对干旱、低温、高盐及外源ABA等处理均存在不同程度的响应。5.利用gateway技术将GmMYBJ1构建到植物表达载体pCB35SR1R2-GFP上,并转化农杆菌EHA105,利用浸花法侵染拟南芥。干旱胁迫下T3代转基因拟南芥种子萌发率显著高于野生型种子;断水处理16天后转GmMYBJ1基因拟南芥生长状态好于野生型,复水培养10天后转基因植株生长状态明显好于野生型,对死亡率和株高进行统计结果表明:转基因拟南芥各指标均显著高于野生型;干旱处理后转基因拟南芥丙二醛含量明显低于野生型;转GmMYBJ1基因拟南芥离体叶片脱水率低于野生型。低温处理7天后转基因拟南芥生长状态好于野生型,恢复培养15天后野生型拟南芥大部分死亡,死亡率和株高统计显示:转基因拟南芥各指标均显著高于野生型;转基因拟南芥各株系可溶性糖的含量均极显著高于野生型。利用半定量RT-PCR对T3代转基因拟南芥中抗逆相关基因表达情况进行分析,结果显示多个与干旱、低温等逆境相关的基因表达量上调,如AtRD29B, AtCOR47, AtCOR78, AtCOR15a及AtP5CS;而AtDREB2A的表达量稍有下降。以上结果表明:GmMYBJ1提高了转基因拟南芥抗低温、抗干旱的能力。6.利用gateway技术将GmMYBJ2构建到植物表达载体pCB35SR1R2-GFP上,转化农杆菌EHA105,利用浸花法侵染拟南芥。在甘露醇模拟干旱胁迫条件下T3代转基因拟南芥种子萌发率显著高于野生型种子;在长达19天的断水处理后转基因拟南芥生长优于野生型;分别测定转基因各株系和野生型植株的可溶性糖含量,结果表明转基因各株系可溶性糖含量均极显著高于野生型;离体叶片脱水率测定实验表明:转基因拟南芥具有更强的保水能力。此外,转基因拟南芥中,多个与逆境应答有关的下游基因表达量上调。以上结果初步表明:GmMYBJ2能够提高转基因拟南芥的抗旱能力。
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