脑卒中是一种常见的神经系统疾病,缺血性脑卒中是引起人类死亡的三大原因之一,其高发病率、高死亡率、高致残率给社会和人民生活带来了巨大的负担。脑缺血涉及的机制十分复杂,是一个多环节、多因素、多机制的恶性级联过程,如:兴奋性毒性氨基酸释放、细胞内钙超载、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡、梗死周围去极化等。其中炎症反应是引起神经元损伤的重要因素。研究发现,脑缺血后,多种炎性细胞因子表达和炎症细胞在缺血区内浸润,促进炎症性损伤的发生和发展,导致缺血区脑组织坏死,并加重脑水肿和神经元的损伤。因此,以神经炎症的调控为切入点进行相关研究有助于明确CNS炎性相关疾病的发病机理,同时也有益于发现相关疾病的新治疗靶点。单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白1(MCP-induced protein 1,MCPIP1),是近年来新发现的一种CCCH型锌指蛋白,参与了心脏病、炎症性疾病、自身免疫性疾病的病理学过程。MCPIP能够参与脑缺血后的炎症调控,具有抑制脑缺血早期炎症反应的作用,研究发现其可能通过调节NF-κB通路的活性从而发挥抗炎作用。蜂毒肽(melittin,MEL)又称蜂毒溶血肽,是一种小分子多肽类生物毒素,约占蜂毒干重的50%左右,是蜜蜂毒中主要的功能物质。它是由26个氨基酸组成的线性多肽,具有较强的表面活性,能通过卵磷脂膜和混合膜。蜂毒肽MEL具有许多生物学活性,包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗风湿等活性。研究涵盖感染性疾病、风湿性关节炎、动脉硬化和肿瘤方向。近期有研究通过体内和体外实验证实,MEL能够通过抗凋亡、抑制NF-κB信号通路的抗炎症反应作用在神经系统变性疾病肌萎缩侧索硬化中发挥神经保护和器官保护作用。基于既往文献研究,我们推测蜂毒肽可通过抑制神经系统炎症反应而在缺血性脑损伤中发挥保护作用,因此本研究采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立电凝法远端大脑中动脉闭塞(distal middlecerebral artery occlusion,dMCAO)模型,通过行为学、形态学及分子生物学等多个层面,观察蜂毒肽对局灶性脑缺血小鼠潜在的神经保护及抗炎症损伤作用,并建立了脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)BV2小胶质细胞炎症损伤模型,并且通过转染敲低BV2小胶质细胞内MCPIP1基因,探讨蜂毒肽是否通过调节MCPIP1蛋白水平和NF-κB信号通路,降低炎症反应,从而发挥神经保护作用,同时也进一步研究证实了炎症保护因子MCPIP1与TLR4/NF-κB信号通路相互作用关系,以期为缺血性脑卒中的治疗和预防提供更多科研依据和研究思路。第一部分蜂毒肽对局灶性脑缺血小鼠的神经功能保护及抗炎症损伤作用目的:通过评价蜂毒肽处理后局灶性脑缺血小鼠的神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积变化,及脑血流量的检测评价蜂毒肽对局灶性脑缺血小鼠的神经保护作用并确定有效剂量。再通过检测各炎性因子的转录和翻译水平,研究蜂毒肽的抗炎症损伤作用。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电凝法建立dMCAO模型。将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:蜂毒肽低剂量组0.1μg/g、中剂量组0.2μg/g、高剂量组0.4μg/g。小鼠术术后即刻给药1次,后每日1次,直至取材。Sham组(假手术组)和Vehicle组(大脑中动脉闭塞组)分别于相应时间点给予等体积生理盐水腹腔注射。对各实验组小鼠进行mNSS评分、体重监测、跑轮实验等行为学评估,以及TTC染色法测定脑梗死体积,干湿重法测定脑组织含水量,激光散斑实时监测脑缺血后两半球的脑血流量,以及通过qRT-PCR、Western blot、ELISA法检测并分析各组小鼠的炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB、MCPIP1的mRNA和蛋白水平,从而评价蜂毒肽对局灶性脑缺血小鼠的神经保护作用。结果:1.体重变化结果示:Sham组小鼠和dMCAO术后各组小鼠于24h、48h、72h与术前相比体重均有显著下降(P<0.01);但Vehicle组各观察时间点与Sham组相比均无显著差异(P>0.05);各时间点,不同剂量给药组与Vehicle组相比,差异亦无统计学意义(P>0.05)。2.mNSS结果示:在脑缺血之前,小鼠没有表现出神经功能缺陷,dMCAO术后24h、48h、72h神经功能均表现出明显下降(P<0.01);术后24h各剂量给药组与Vehicle组相比评分无明显差异(P>0.05),但48h、72h后MEL中、高剂量组较Vehicle组神经功能有显著恢复(P<0.05),且神经功能恢复呈剂量相关性(P<0.05)。3.Rota-Rod test结果显示:各组小鼠dMCAO术后24h神经功能显著降低(P<0.01),Vehicle组与高剂量MEL药物处理组相比,神经功能下降更加明显(P<0.05)。术后48h、72h,中、高剂量MEL组较Vehicle组,神经功能恢复更加显著(48h:P<0.05;72h:P<0.01),且神经功能恢复呈剂量相关性(P<0.05)。4.TTC法测定脑梗死体积结果显示,MEL组与Vehicle组相比,术后24h、48h、72h脑梗死体积均有缩小(24h,72h:P<0.05;48h:P<0.01)。5.通过干湿称重法检测脑组织含水量结果显示,随时间延长,Vehicle组小鼠病灶侧脑组织含水量逐渐升高,以72h升高最为明显(P<0.05)。MEL组与Vehicle组相比,病灶侧脑组织含水量于24h、48h、72h均比同时段的Vehicle组显著下降(P<0.05)。6.脑血流量监测结果显示,各组小鼠dMCAO术后24h至72h各观察时间点,病灶侧和对侧CBF均显著下降(P<0.01)。MEL组于术后即刻、术后6h的病灶侧CBF与Vehicle组基本持平,无显著差异,但在12h至72h病灶侧脑血流灌注恢复更加明显(P<0.05)。Vehicle组和MEL组的病灶对侧CBF均于6h缓慢恢复,两组之间无明显差异(P>0.05)。7.qRT-PCR结果显示,蜂毒肽能够降低缺血脑组织炎性因子IL-1β(Vehicle vs.Sham:P<0.01;MEL-L vs.Vehicle:P>0.05;MEL-M vs.Vehicle:P<0.05;MEL-H vs.Vehicle:P<0.01)、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88、NF-κB(Vehicle vs.Sham:P<0.001;MEL-L vs.Vehicle:P>0.05;MEL-M vs.Vehicle:P<0.05;MEL-H vs.Vehicle:P<0.05)mRNA水平。8.ELISA结果显示,蜂毒肽能够降低缺血脑组织炎性因子IL-1β(Vehicle vs.Sham:P<0.001;MEL-L vs.Vehicle:P>0.05;MEL-M vs.Vehicle:P<0.01;MEL-H vs.Vehicle:P<0.01)、IL-6(Vehicle vs.Sham:P<0.001;MEL-L vs.Vehicle:P>0.05;MEL-M vs.Vehicle:P<0.05;MELH vs.Vehicle:P<0.01)、TNFα(Vehicle vs.Sham:P<0.05;MEL-L vs.Vehicle:P>0.05;MEL-M vs.Vehicle:P<0.05;MEL-H vs.Vehicle:P<0.05)的蛋白浓度水平。9.根据上述结果,我们选取了MEL高剂量处理组代表药物处理组进行Western blot实验,结果显示,与Vehicle组相比,MEL处理组能够显著下调TLR4(Vehicle vs.Sham:P<0.01;MEL vs.Vehicle:P<0.05)、MyD88(Vehicle vs.Sham:P<0.05;MEL vs.Vehicle:P<0.05)以及NF-κB(Vehicle vs.Sham:P<0.05;MEL vs.Vehicle:P<0.05)的蛋白表达水平,持续上调MCPIP1(Vehicle vs.Sham:P<0.001;MEL vs.Vehicle:P<0.001)蛋白水平。第二部分蜂毒肽对鼠小胶质细胞炎症损伤的保护作用目的:构建体外炎症反应模型,检测LPS不同处理时间细胞炎性因子的变化,以及检测MEL药物处理后各炎性因子的变化,以研究MEL的神经保护作用是否是通过抗炎作用而发挥。方法:LPS诱导BV2小胶质细胞构建体外炎症反应模型,按LPS处理时间分为以下组:LPS 3h组、LPS 6h组、LPS 12h组、LPS 24h组。qRT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB表达水平。给予MEL低(0.5μg/ml)、中(1μg/ml)、高剂量(2μg/ml)处理,通过qRT-PCR、Western blot、ELISA法检测并分析各组细胞的炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB和MCPIP1的mRNA和蛋白水平,细胞免疫荧光检测MCPIP1的表达定位以及药物处理后NF-κB的入核情况,并收集处理后BV2的细胞上清与SH-SY5Y共孵育检测其神经毒性,从而评价MEL对BV2炎性损伤的神经保护作用。结果:1.qRT-PCR法检测LPS处理不同时间对BV2炎症损伤后mRNA的影响,结果显示,与Control组相比,IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB和MCPIP1的mRNA水平均随LPS处理时间延长而升高(P<0.05),提示体外炎症模型构建成功。2.ELISA法检测蜂毒肽对LPS诱导BV2炎性损伤后炎性因子水平的影响,结果显示,与LPS处理组相比,MEL中、高浓度组IL-1β、IL-6、TNFα蛋白水平显著下降(P<0.05)。3.Western blot结果显示,与LPS处理组相比,低、中、高MEL药物处理后,TLR4、MyD88以及NF-κB的蛋白水平均有所下降(P<0.01)。与LPS处理组相比,MEL药物处理组抗炎因子MCPIP1的蛋白水平持续升高(P<0.01)。4.蜂毒肽对LPS诱导BV2炎性损伤后NF-κB核定位的影响细胞免疫荧光结果显示,静息状态下,NF-κB(p65亚单位)主要定位于细胞浆内;给予LPS刺激后,NF-κB核定位增加,表明该通路处于激活状态;给予MEL处理后再给予LPS处理,则发现NF-κB向细胞核的迁移受到抑制。5.蜂毒肽对LPS诱导BV2炎性代谢产物的神经元毒性的影响为探讨BV2炎症损伤后的细胞炎性代谢产物对神经元毒性作用,模拟体内脑缺血后病理生理过程,本实验应用BV2细胞处理后的细胞上清与SH-SY5Y共孵育,通过检测孵育后SH-SY5Y的细胞活力及凋亡相关因子的变化,反映小胶质细胞的炎性代谢产物对神经细胞的影响。结果显示,与Control组相比,LPS处理BV2的上清所孵育的SH-SY5Y细胞活力下降明显(P<0.01),中、高浓度组MEL药物处理后的BV2细胞上清相对毒性下降,细胞活力升高(P<0.05)。通过q RTPCR检测处理后SH-SY5Y细胞凋亡相关因子的mRNA水平评价神经细胞的活力。结果显示,LPS处理后,与Control组相比,Bax、AIF mRNA水平显著下降(P<0.01),Bcl-2水平显著上升(P<0.01)。与LPS组相比,中、高浓度MEL药物处理组的细胞上清孵育的SH-SY5Y Bax、AIF mRNA水平明显升高(P<0.01),Bcl-2水平下降(P<0.05),提示药物处理组的细胞活力增加。第三部分蜂毒肽对BV2细胞炎症损伤的保护作用相关机制研究目的:本实验应用si-RNA转染BV2细胞对MCPIP1基因进行敲低,检测各炎症因子的变化,探究MEL的抗炎作用机制是否与MCPIP1蛋白相关。方法:将MCPIP1的si-RNA转染入BV2细胞,再进行LPS处理及MEL药物处理,将细胞分为si-Control组和si-ZC3H12A组,通过q RTPCR、Western blot、ELISA法检测并分析各组细胞的炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB的mRNA和蛋白水平,细胞免疫荧光检测NF-κB的入核情况,并收集处理后BV2的细胞上清与SHSY5Y共孵育检测其神经毒性,从而探讨MEL的抗炎作用机制是否与MCPIP1蛋白相关。结果:1.关于转染效率检测,分别通过qRT-PCR、Western blot检测siRNA转染效率,结果提示,si-ZC3H12A转染BV2细胞后,与si-Control相比,MCPIP1的mRNA水平和蛋白表达水平均明显下降(P<0.01),证明转染成功。2.为了进一步研究MCPIP对IL-1β、IL-6、TNFα的影响,以及MCPIP与NF-κB之间的关系,本实验在成功敲低MCPIP1基因和蛋白的表达后,再给予LPS诱导炎性反应和MEL药物处理,分别通过qRTPCR、ELISA、Western blot检测IL-1β、IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB各炎性因子的mRNA和蛋白表达的变化,结果显示,MCPIP1敲低后,IL-1βmRNA和蛋白水平与si-Control组无显著差异(P>0.05),IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB的mRNA水平均升高(P<0.05);IL-6、TNFα、TLR4、MyD88以及NF-κB蛋白表达水平于MCPIP1敲除后均升高(IL-6,TNFα,TLR4,NF-κB:P<0.05;MyD88:P<0.01 vs.si-Control)。应用细胞免疫荧光技术检测结果发现siZC3H12A组NF-κB核内表达较si-Control组增多,提示MCPIP1基因敲除后,MEL的抗炎症作用较前减弱,说明MEL的抗炎作用是通过MCPIP1蛋白介导,影响了TLR4/MyD88/NF-κB通路的信号转导而发挥效用的。3.si-RNA转染BV2细胞后细胞上清对SH-SY5Y的神经元毒性检测结果显示,CCK-8和LDH检测结果提示,与si-Control组相比,siZC3H12A组的细胞上清孵育的SH-SY5Y活性下降(P<0.01);qRTPCR提示,si-ZC3H12A组与si-Control组相比,AIF、Bax凋亡相关因子mRNA水平下降(P<0.01),Bcl mRNA水平升高(P<0.01),同样提示了对于敲除MCPIP1的BV2细胞,尽管给予MEL药物处理,其LPS诱导炎性损伤的细胞上清对神经元的毒性增加,证实了MEL的抗炎及神经保护作用由MCPIP1介导完成。结论:1.蜂毒肽能够促进局灶性脑缺血小鼠的神经功能恢复,减小脑梗死体积,减轻脑组织水肿,促进缺血脑组织的血流恢复,并且能够抑制缺血脑组织织炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关因子的表达,促进抗炎因子MCPIP1的表达,具有抗炎症损伤和神经保护作用。2.蜂毒肽能够抑制LPS诱导的BV2细胞中炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路各关键因子的基因及蛋白水平的增加,以及抑制NF-κB向细胞核内的转移,能够降低BV2炎性代谢产物对神经元的毒性,说明蜂毒肽很可能是通过抗炎症反应活性而发挥其神经保护作用的。3.蜂毒肽能够诱导MCPIP1在小鼠脑组织中和BV2小胶质细胞中在脑缺血和炎性损伤过程中的持续表达,且在炎症损伤BV2细胞中MCPIP1功能缺失后,蜂毒肽处理对炎症相关因子IL-1β、IL-6、TNFα以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的抑制作用减弱,说明蜂毒肽的抗炎活性是通过MCPIP1介导,从而抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的转导而发挥作用的。