论文部分内容阅读
[目的]研究不同浓度氟化钠对小鼠睾丸支持细胞间紧密连接的影响,并对小鼠的睾丸支持细胞进行了体外毒性试验,探究氟对睾丸支持细胞免疫豁免功能的影响,为进一步探讨氟对雄性动物生殖功能的损伤机理奠定基础。[方法]将100只8周龄左右的雄性昆明小鼠随机分为4个试验组(对照组饮用去离子水,低氟组饮用25mg/L NaF的去离子水,中氟组饮用50mg/L NaF的去离子水,高氟组饮用100mg/L NaF的去离子水,饲料均为标准颗粒饲料),攻氟时间为8周,整个试验期间定期记录各试验组小鼠的饮水量及体重。攻毒结束后,计算小鼠的日均摄氟量；测定股氟含量；并摘取睾丸,在电子显微镜下观察睾丸支持细胞的紧密连接。选取出生15-20天左右的雄性小鼠,摘取睾丸,采用酶消化法(胶原酶和胰酶)分离培养睾丸支持细胞,并进行NaF毒性试验,根据毒性试验结果确定体外培养支持细胞攻氟浓度分别为对照组Omol/L,低氟组10-5mol/L,中氟组10-4mol/L,高氟组10-3mol/L,每个剂量组设15个平行样,置于5%C02、37℃培养箱中继续培养48h。攻毒结束后弃去培养液,收集细胞并计数,将106个细胞注射到同种异体小鼠的肾包膜下,术后20天处死动物,取出含移植物的肾脏,常规制备病理切片,采用SABC法检测移植物中蛋白的表达,并用TUNEL技术对移植物中淋巴细胞的凋亡状况进行检测。另外,提取攻毒后支持细胞的总nRNA和总蛋白,采用RT-PCR、Western-blot的方法检测与睾丸支持细胞免疫豁免功能相关的基因与蛋白。[结果]1.各试验组小鼠体重均呈上升趋势,但氟处理组小鼠的体重与对照组相比无显著性差异。股氟含量测定结果显示：低氟组、中氟组和高氟组小鼠股氟含量明显上升,与对照组相比差异显著(P<0.05)。2.电镜结果表明：对照组的紧密连接形态完整,呈连续的电子密度较深致密线,且在连结的两侧可看到典型的细胞外质特化区(ES)；低剂量组与对照组相比,变化不明显；中剂量组偶尔会看到很长,但是很细的紧密连接；高剂量组基本观察不到支持细胞间的紧密连接。3.同种异体肾包膜下移植20天后可见在肾包膜下有一白丘状突起,常规切片,HE染色显示肾包膜下有大量的异体细胞,同时肾包膜下移植物的GATA4免疫组化染色证明,有大量阳性棕黄色细胞团聚集在肾包膜下,即为支持细胞。TUNEL法做凋亡观察,可见移植物中有散在的淋巴细胞,胞核棕黄色,且高氟组淋巴细胞凋亡率与对照组先比显著降低。4. RT-PCR结果显示,TGF-β1 mRNA的表达量降低,且在100mg/L氟化钠组较对照组相比差异显著,而25、50mg/L氟化钠组较对照组相比无显著性变化；FasL mRNA的表达量也降低,100mg/L的氟化钠组较对照组相比差异显著；其它相关基因的表达量较对照组相比均无显著性差异。5.Western-blot结果显示与对照组相比各实验组FasL蛋白表达水平呈下降趋势,高氟组的蛋白表达量与对照组相比差异显著；随染氟浓度升高,TGF-β1的蛋白表达水平与对照组相比,高氟组显著,低氟组与中氟组不显著。[结论]试验结果表明：一定浓度的氟会影响睾丸支持细胞的间的紧密连接结构,并且降低睾丸支持细胞的免疫豁免功能。其影响机制与支持细胞内TGF-β1及FasL的蛋白与mRNA表达水平的降低有关,为进一步探讨氟对雄性动物生殖功能的损伤机理奠定理论基础。