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西瓜、黄瓜和甜瓜是重要的葫芦科瓜类作物,乙烯对瓜类作物果实的成熟、性别分化和产量具有重要影响,因此探索乙烯生物合成、信号转导与瓜类作物果实发育、性别分化和产量的关系一直是瓜类作物的研究重点。目前,多数研究集中在黄瓜、甜瓜乙烯生物合成和信号转导途径中相关基因的分离、克隆,关于西瓜乙烯合成和信号转导途径中关键基因克隆的研究报道相对较少。本试验依据甜瓜、黄瓜等作物乙烯合成和信号转导途径中关键基因的保守序列设计引物,分别以西瓜的强雌性(新红宝突变体)/普通性型材料(新红宝)以及黄瓜的强雌性(欧洲8号)/普通性型材料(秋棚)基因组DNA为模板,采用同源序列克隆方法从西瓜、黄瓜基因组中分别克隆获得ACS、ACO、ETR1、ETR2、ERS、EIN3、ERF等7个乙烯合成和信号转导途径中关键酶的基因/片段。同时利用生物信息学方法对相关瓜类作物基因/片段序列进行比较分析和功能预测,对进一步研究瓜类作物性别分化的分子调控机制具有实践意义。实验结果如下:1根据ACS基因的保守序列设计引物,分别从西瓜新红宝突变体和新红宝基因组DNA中克隆获得一条具有完整阅读框的ACS基因序列,二者核苷酸序列100%相同,命名为CLACS。CLACS全长3385bp,该序列编码区长度为1485bp,编码494个氨基酸,与报道的甜瓜、黄瓜ACS氨基酸序列同源性都在90%以上。CLACS蛋白质有7个保守的区域,其中第5个保守区为ACS酶的活性中心。推测CLACS的分子量为5.57KD,等电点为6.61,其三维结构与番茄ACS(MMDB:15810;PDB:1IAX)的三维晶体结构十分类似。2根据ACO基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1522bp的西瓜基因片段,命名为CLACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长912bp,编码303个氨基酸;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1270bp的黄瓜基因片段,命名为CSACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长909bp,编码302个氨基酸。CLACO和CSACO的编码序列92.3%同源,氨基酸序列93.4%同源。推测CLACO、CSACO蛋白质三级结构与矮牵牛中的ACO蛋白质(MMDB:35451;PDB:1W9Y)的三维晶体结构类似。系统进化树分析表明,CLACO和CSACO片段与葫芦科作物中的同类基因亲缘关系最近。3根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1633bp的基因片段,命名为CLETR1;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1491bp的黄瓜基因片段,命名为CSETR1。去除内含子后,CLETR1和CSETR1编码序列均为795bp,编码264个氨基酸,二者编码序列96%同源,氨基酸序列98%同源。CLETR1和CSETR1的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷酸位点存在SNPs,其中5个SNPs导致4个编码氨基酸的改变。4根据ETR2基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致基因片段,命名为CLETR2;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致的黄瓜基因片段,命名为CSETR2。CLETR2和CSETR2序列长度均为417bp,属于编码区序列,推测编码138个氨基酸,二者编码区序列同源达95.68%,氨基酸序列98.5%同源。获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有REC信号保守结构域特征,结构域三维结构预测与拟南芥乙烯受体(PDB:1DCF_A)的三维晶体结构相似性极高。5根据ERS基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为837bp西瓜基因片段,命名为CLERS;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为757bp黄瓜基因片段,命名为CSERS。CLERS和CSERS都由2个外显子片段、1个内含子和3’UTR区组成,编码序列长度均为291bp,编码96个氨基酸,二者编码区序列94.85%同源,氨基酸序列93.76%同源,获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有HATPase-c保守结构域特征。6根据西瓜果实发育EST文库中相关EIN3序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为603bp的西瓜基因片段,命名为CLEIN3;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列长度分别为619bp和604bp的基因片段,命名为CSEIN3A、CSEIN3B,三者编码序列长度分别为399bp、423bp、408bp,推测编码132、140、135个氨基酸。三者编码区序列92.83%同源,氨基酸序列93.1%同源。CSEIN3A比CSEIN3B在靠近羧基端多5个天冬酰胺。7根据本实验室西瓜枯萎病菌SSH文库中相关ERF的序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为627bp西瓜基因片段,命名为CLERF;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为625bp黄瓜基因片段,命名为CSERF。CLERF和CSERF编码序列长度均为363bp,推测编码120个氨基酸,二者编码区序列94.49%同源,氨基酸序列95%同源。