目的:通过检测清肾颗粒含药血清低、中、高三个剂量组的对高糖诱导的人肾小管上皮细胞(Human renal tubular epithelial cells,HK-2)中活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量以及核转录因子-κB p65(nuclear factors-κBp65,NF-κB p65)、磷酸化的NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、IκB激酶(IκKα)和单核细胞趋化性蛋白-1(Monocytechemotatic protein-1,MCP-1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(alphasmooth muscle actin,α-SMA)的蛋白表达情况;探讨清肾颗粒含药血清各剂量组是否能抑制高糖诱导的HK-2细胞中氧化应激介导的NF-κB信号通道的活化,从而减轻HK-2细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),进而抑制肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的发生与发展。方法:选用健康日本雄性大耳白兔6只,体重2.5±0.2 kg,全部购自安徽医科大学实验动物中心,随机分为药物组和空白组,每组3只。药物组将清肾颗粒配成1.0g/ml药液,每只兔每次按5ml/kg灌胃,1次/d,连续10d。末次灌胃1h后,无麻醉状态下,注射器心脏采血,常温静置2h后,3000r/min离心10min,分离获得兔含药血清混合均匀后,立即在超净工作台用一次性0.22μm微孔滤膜过滤除菌,56℃,30min水浴灭活,置-20℃保存备用。空白组予以等量生理盐水灌胃,并如上制备兔空白血清。HK-2细胞株全部购自中国典型培养物保藏中心细胞库(武汉),实验使用第2-3代细胞。选用同代细胞随机分为7组,包括空白对照组、渗透压对照组、高糖组、清肾颗粒低、中、高剂量组、吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组细胞活性;流式细胞术检测HK-2细胞中ROS、MDA、SOD的含量;凝胶迁移法检测HK-2细胞中NF-κB p65的DNA结合活性变化;Western blot法检测HK-2细胞中NF-κB p65、p-IκBα、IκKα、MCP-1、ICAM-1的蛋白表达水平;免疫细胞化学法检测HK-2细胞中NF-κB p65、E-cadherin、α-SMA的蛋白表达情况。结果:1.MTT结果表明药物作用48小时后:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各组、PDTC各组OD值均低于空白对照组,均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各组及5μmol/LPDTC组OD值均高于高糖组,且均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组OD值高于清肾颗粒中、高剂量组,且均有统计学意义(P<0.01),但与5μmol/LPDTC组无差异(P>0.05);清肾颗粒中剂量组与高剂量组无差异(P>0.05),且OD值均低于5μmol/LPDTC组;渗透压对照组与空白对照组无差异(P>0.05)。参照MTT结果最终选择药物作用时间为48小时,PDTC药物浓度选择为5μmol/L。2.ROS、MDA、SOD含量比较:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组ROS、MDA表达均增强,差异均有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组及PDTC组ROS、MDA表达均减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);清肾颗粒低、中、高剂量组比较,清肾颗粒低剂量组中ROS、MDA表达最弱,差异均有统计学意义(P<0.05);清肾颗粒低剂量组与PDTC组无明显差异(P>0.05);与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组SOD活性均下降,差异均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组、PDTC组SOD活性均增强,差异均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组与PDTC组SOD活性无差异(P>0.05),且高于清肾颗粒中剂量组与高剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.各组细胞中NF-κB p65的DNA结合活性比较(EMSA法):与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组的NF-κB p65的DNA结合活性均增强,差异均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组、PDTC组的NF-κB p65的DNA结合活性均降低,差异均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组的NF-κB p65的DNA结合活性低于清肾颗粒低剂量组与高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);清肾颗粒高剂量组的NF-κB p65的DNA结合活性低于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);PDTC组的NF-κB p65的DNA结合活性低于清肾颗粒中剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);空白对照组的NF-κB p65的DNA结合活性低于渗透压对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.各组细胞中NF-κB p65、p-IκBα、IκKα蛋白表达情况比较(Western blot法):⑴NF-κB p65蛋白表达情况比较:与空白对照组比较,其他各组细胞NF-κB p65蛋白表达均增高,清肾颗粒中剂量组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05),高糖组、清肾颗粒高剂量组分别与空白对照组比较,均具有统计学意义(P<0.01),而清肾颗粒低剂量组、PDTC组、渗透压对照组分别与空白对照组比较均无差异(P>0.05);与高糖组比较,清肾颗粒低剂量组与PDTC组NF-κB p65蛋白表达显著降低,均具有统计学意义(P<0.01),清肾颗粒中剂量组NF-κB p65蛋白与高糖组比较表达降低,有统计学意义(P<0.05),清肾颗粒高剂量组与高糖组比较无差异(P>0.05);清肾颗粒中剂量组与高剂量组比较无差异(P>0.05);清肾颗粒低剂量组与PDTC组的NF-κB p65蛋白表达无差异(P>0.05),且均低于清肾颗粒中、高剂量组。⑵p-IκBα蛋白表达情况比较:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组的p-IκBα蛋白表达均增加,均具有统计学意义(P<0.01),清肾颗粒低剂量组与空白对照组无差异(P>0.05);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组及PDTC组的p-IκBα蛋白表达均降低,且均具有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组中,清肾颗粒低剂量组的p-IκBα蛋白表达最低,分别与清肾颗粒中剂量组、高剂量组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),但与PDTC组无明显差异(P>0.05);清肾颗粒中剂量组与高剂量组比较无明显差异(P>0.05);空白对照组与渗透压对照组比较无明显差异(P>0.05)。⑶IκKα蛋白表达情况比较:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组IκKα蛋白表达均增加,清肾颗粒低剂量组与空白对照组比较无明显差异(P>0.05),PDTC组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05),其余各组与空白对照组比较均具有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组与PDTC组的IκKα蛋白表达均减少,清肾颗粒中剂量组与高糖组比较有统计学意义(P<0.05),其余各组与高糖组比较均具有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组中,低剂量组的IκKα蛋白表达最低,与清肾颗粒中、高剂量组均有统计学意义(P<0.05),但与PDTC组无明显差异(P>0.05);清肾颗粒中剂量组与高剂量组比较无明显差异(P>0.05)。5.各组细胞中MCP-1和ICAM-1蛋白表达情况比较(Western blot法):⑴MCP-1蛋白表达情况比较:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组MCP-1蛋白表达均增加,均具有统计学意义(P<0.01),渗透压对照组与空白对照组比较无差异(P>0.05);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组与PDTC组的MCP-1蛋白表达均减少,清肾颗粒低、中剂量组、PDTC组分别与高糖组比较,均具有统计学意义(P<0.01),清肾颗粒高剂量组与高糖组比较无明显差异(P>0.05);清肾颗粒各组中,清肾颗粒低剂量组的MCP-1蛋白表达最低,但与清肾颗粒中剂量组和PDTC组均无差异(P>0.05)。⑵ICAM-1蛋白表达情况比较:与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组ICAM-1蛋白表达均增加,均具有统计学意义(P<0.05),渗透压对照组与空白对照组比较无差异(P>0.05);与高糖组比较,清肾颗粒各剂量组与PDTC组的ICAM-1蛋白表达均减少,清肾颗粒低、中剂量组、PDTC组分别与高糖组比较,均具有统计学意义(P<0.05),清肾颗粒高剂量组与高糖组比较无明显差异(P>0.05);清肾颗粒各组中,清肾颗粒低剂量组的ICAM-1蛋白表达最低,亦低于PDTC组,且均具有统计学意义(P<0.05)。6.各组细胞中NF-κB p65表达情况比较(免疫细胞化学法):与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组表达NF-κB p65的阳性细胞所占比率均升高,均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各组与PDTC组表达NF-κB p65的阳性细胞所占比率均降低,且均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组中,清肾颗粒低剂量组表达NF-κB p65的阳性细胞所占比率最低,且分别与中剂量、高剂量组比较,均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组表达NF-κB p65的阳性细胞所占比率低于高剂量组,差异有统计学意义(P<0.01);PDTC组表达NF-κB p65的阳性细胞所占比率低于清肾颗粒低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);渗透压对照组与空白对照组的NF-κB p65阳性细胞所占比率无差异(P>0.05)。7.各组细胞中E-cadherin表达情况比较(免疫细胞化学法):与空白对照组比较,高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率均降低,均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各组与PDTC组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率均升高,清肾颗粒低剂量组、中剂量组与PDTC组分别与高糖组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),高剂量组与高糖组比较有统计学意义(P<0.05);清肾颗粒各剂量组中,清肾颗粒低剂量组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率最高,且分别与中剂量、高剂量组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),清肾颗粒中剂量组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率高于高剂量组,差异有统计学意义(P<0.01);PDTC组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率低于清肾颗粒低剂量组,差异有统计学意义(P<0.01);渗透压对照组与空白对照组表达E-cadherin的阳性细胞所占比率无差异(P>0.05)。8.各组细胞中α-SMA表达情况比较(免疫细胞化学法):与空白对照组比较,渗透压对照组表达α-SMA的阳性细胞所占比率偏低,而高糖组、清肾颗粒各剂量组、PDTC组表达α-SMA的阳性细胞所占比率与空白对照组比较均升高,均有统计学意义(P<0.01);与高糖组比较,清肾颗粒各组、PDTC组表达α-SMA的阳性细胞所占比率均降低,且均有统计学意义(P<0.01);清肾颗粒各剂量组中,清肾颗粒低剂量组表达α-SMA的阳性细胞所占比率最低,与中剂量、高剂量组均有统计学意义(P<0.01),清肾颗粒中剂量组表达α-SMA的阳性细胞所占比率低于高剂量组,有统计学意义(P<0.01);PDTC组表达α-SMA的阳性细胞所占比率高于清肾颗粒低剂量组,有统计学意义(P<0.01)。结论:1.高糖可以诱导HK-2细胞发生EMT且与渗透压无关;2.清肾颗粒含药血清可以抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT进程的发生;3.氧化应激介导的NF-κB信号通道的激活参与了HK-2细胞的EMT进程与RIF的发生;4.清肾颗粒含药血清可通过抑制氧化应激介导的NF-κB信号通道的激活,从而降低高糖诱导的HK-2细胞中ROS、MDA,升高SOD水平,减少高糖诱导的HK-2细胞中NF-κB p65、p-IκBα、IκKα、MCP-1、ICAM-1、α-SMA的蛋白表达,上调E-cadherin的表达,从而抑制高糖诱导的HK-2细胞的EMT进程,延缓RIF的进展。5.清肾颗粒含药血清低剂量组对抑制高糖诱导的氧化应激介导的NF-κB信号通道的激活,阻止HK-2细胞的EMT进程,延缓RIF的进展,明显优于清肾颗粒含药血清中、高剂量组。