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目的：利用基因工程技术把TAT-EGF-GFP融合基因(TAEGF-GFP)与表达载体连接后导入宿主菌中，使其高效表达TAEGF-GFP融合蛋白，经复性、纯化后得到TAEGF-GFP融合蛋白，进一步酶切得到TAEGF融合蛋白。通过细胞穿膜实验评价TAEGF-GFP穿膜活性，细胞活性和SD大鼠创伤实验评价TAEGF融合蛋白创伤修复活性，为进一步开发TAEGF融合蛋白创新药物奠定基础，并为相关基因工程药物的开发提供实验依据。
方法：利用PCR技术，分别从PUC19-EGF、PUC19-GFP质粒中扩增出EGF、GFP基因片段，以EGF基因为模板，使用含有TAT基因片段的引物扩增出TAEGF融合基因，最后以TAEGF、GFP基因为混合模板，扩增出TAEGF-GFP基因片段。将扩增好的TAEGF-GFP基因片段连接到原核表达载体pET20b+上，构建重组原核表达载体pET20b-TAEGF-GFP，并将重组表达载体转化到Rossate(DE3)宿主菌，然后进行菌落PCR、酶切鉴定和测序。选择阳性菌落进行液体培养，经IPTG诱导表达TAEGF-GFP融合蛋白，将表达产物进行SDS-PAGE分析鉴定。大量表达的融合蛋白，经肝素亲和层析，得到纯化的融合蛋白后，进行体外蛋白质的穿膜实验。同时对TAEGF-GFP融合蛋白进行酶切，得到TAEGF融合蛋白，再进行Western blotting分析、NIH3T3细胞生物活性研究及SD大鼠创伤模型修复研究。
结果：重组质粒PET20b-TAEGF-GFP经限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切，得到987bp的片段与理论值符合，同时DNA测序结果也证实成功构建了pET20b-TAEGF-GFP重组质粒。经IPTG诱导后，TAEGF-GFP融合蛋白在Rossate(DE3)菌中得到了大量表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约35KD与预期相符。融合蛋白通过肝素亲和层析，获得了纯度较高的TAEGF-GFP融合蛋白，经Western blotting分析表明融合蛋白能与EGF抗体具有特异结合能力。纯化蛋白经体外穿膜实验，结果显示表达的TAEGF-GFP融合蛋白具有细胞穿膜功能。纯化的TAEGF-GFP融合蛋白，经肠激酶酶切后得到TAEGF融合蛋白，MTT法检测表明，纯化的融合蛋白具有促进NIH3T3细胞增殖作用，与阳性对照组EGF的生物活性基本一致。同时对SD大鼠创伤模型修复结果表明，TAEGF融合蛋白有明显的修复伤口愈合的效果，显著高于空白对照组。
结论：本研究成功构建了TAEGF-GFP融合基因，并在Rossate(DE3)菌中得到了大量表达。经复性和纯化后，体外细胞穿膜实验证实，TAEGF-GFP融合蛋白能够穿过NIH3T3细胞膜。酶切后得到了具有活性的TAEGF融合蛋白，体外试验证实了TAEGF融合蛋白具有促细胞增殖活性，且能促进SD大鼠创伤模型修复活性，为日后开发TAEGF融合蛋白创新药物提供了实验依据。