极端嗜热蛋白酶Pyrolysin是从海洋极端嗜热古生菌Pyrococcus furiosus的细胞外层结构中分离到的一个枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶。Pyrolysin是Pyrolysin蛋白酶家族中的模式酶,在其催化结构域中存在多个插入序列,在其催化结构域的C端存在一个较长的C端延伸区(CTE)。Pyrolysin拥有良好的高温蛋白水解活性和热稳定性,其最适反应温度为115℃,在100℃的半衰期为4h,是目前为止发现的热稳定性最好的蛋白酶之一。鉴于其优良的热稳定性,Pyrolysin是研究蛋白质高温适应性分子机制的理想模型。Pyrolysin前体由信号肽、N端前肽、催化结构域和C端延伸区四部分组成。本实验室前期研究发现Pyrolysin酶原能够在高温条件下通过自加工切除N端前肽和C端前肽,形成由催化结构域和部分C端延伸区(CTEm)构成的成熟酶。目前Pyrolysin的C端延伸区的作用已经相对清楚,但其催化结构域中插入序列的功能仍然是未知的。作为P.furiosus的胞外蛋白酶,Pyrolysin在天然状态下是在富含金属离子的海水中发挥功能的,但该酶在金属离子存在的情况下易发生沉淀以及自降解。对Pyrolysin在富含金属离子溶液中的分子状态以及发生自降解的原因进行解析,有助于我们进一步了解该酶适应海洋高温环境的分子机制。Pyrolysin的催化结构域中存在四个特有的插入序列(Is 147、Is29、Is27和Is8),本研究通过插入序列缺失突变的方式研究了各个插入序列的功能。我们发现插入序列Is147和Is27是Pyrolysin加工成熟所必需的。在插入序列Is147中鉴定到两个新的Ca2+结合位点(Ca3和Ca4),并且这两个Ca2+结合位点都包含有一个Dx[DN]xDG模体。我们的研究表明,Ca3位点与Pyrolysin的热稳定性相关,而Ca4位点则参与了 Pyrolysin的折叠。通过对插入序列缺失突变体成熟酶的性质进行研究,我们发现插入序列Is29对Pyrolysin的活性具有重要影响,插入序列Is8则与Pyrolysin的热稳定性相关。随后,我们研究了 Pyrolysin在富含金属离子溶液中的自降解机制,发现在该酶插入序列Is29和Is27中分别存在一个自降解位点。Pyrolysin通过分子间自降解的方式从这两个自降解位点水解肽键产生五条降解片段。通过突变分析,我们发现在Is27和Is8之间存在静电相互作用,二者之间的离子键在防止Pyrolysin发生自降解,提高该酶热稳定性方面发挥了重要的作用。尽管Pyrolysin在富含金属离子的溶液中易发生自降解,但是该酶产生的自降解产物可以通过非共价键紧密结合在一起形成具有活性的缺刻型酶。此外,我们将Is29中的Arg249突变为Glu,该突变不仅提高了 Pyrolysin热稳定性而且显著增强了该酶对各种金属离子的耐受能力。该结果表明,对Pyrolysin家族成员中额外的结构元件进行突变修饰可进一步提高这类酶的稳定性。最后,我们通过透射电子显微镜检测了 Pyrolysin酶原及成熟酶在人工海水中的聚集状态,发现Pyrolysin酶原形成的是无规则不定形聚集物,而成熟酶形成了有规则的类似淀粉样纤维的聚集物。蛋白底物可以有效调控Pyrolysin成熟酶的聚集状态:一方面可以防止Pyrolysin成熟酶发生沉淀,另一方面可以使沉淀的Pyrolysin成熟酶恢复为可溶状态。我们认为,在海洋环境中蛋白底物不仅可以有效抑制Pyrolysin成熟酶发生分子间的自降解而且还可以将其维持在可溶状态。