前言:喉鳞状细胞癌是困扰头颈部鳞癌患者的最大难题,发病率约占头颈部鳞癌的1/3。在我国,喉癌每年新增病例约为2万例,发病率居高不下。喉癌的主要风险因素是吸烟,其他多种风险因素包括HPV感染、环境与工作接触等。喉癌的易复发和易转移一直是困扰喉癌患者的巨大难题,近年来,经过喉手术、放疗、化疗、基因治疗等综合治疗措施,喉癌患者5年生存率有所提高,但喉癌的复发以及转移仍导致30%～40%的喉癌患者死亡。发展新的治疗模式,结合生物标记物,有选择地在这些患者中应用这种新的治疗方法,可能成为有助于提高生存率的新模式。因此,在喉癌发生发展过程中找寻相关分子生物学机制,探究喉癌侵袭转移相关基因,引入新的生物标记物作为喉癌的预测因子,从而在喉癌早期进行诊疗,是人们需要关注的重点问题。MYCT1（MYC target 1）是本课题组一直关注的潜在抑癌基因。研究发现,MYCT1基因在胃癌、肝癌、喉癌和宫颈癌中低表达,且过表达MYCT1可以显著促进肿瘤细胞凋亡,表明MYCT1具有潜在的抑癌作用。本课题组前期研究结果表明,MYCT1过表达显著降低喉癌Hep-2细胞迁移,促进细胞凋亡。然而,对于MYCT1调节喉癌细胞生物学功能的机制鲜有报道。因此,探究MYCT1调控下游基因的分子机制研究将为喉癌的早期诊疗靶标奠定理论基础。本课题组构建了稳转过表达MYCT1的喉癌Hep-2细胞系,并在前期实验中通过筛查MYCT1蛋白芯片下游差异表达基因,发现ADAM20蛋白（a disintegrin and metalloproteinase 20）在MYCT1过表达细胞系中表达水平显著降低,这一前期结果提示MYCT1对ADAM20可能具有负向调控作用。ADAM20为肿瘤/睾丸抗原（Cancer/Testis Antigen,CTA）基因之一,这类基因正常情况下只在雄性睾丸组织中表达,但在部分恶性肿瘤中重新被激活,鉴于这些重新激活的睾丸蛋白的免疫源性,它们被命名为肿瘤/睾丸抗原（CTA）。研究表明,CTA在肺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤和乳腺癌中重新激活的比例相当大,而在白血病和淋巴瘤以及肾癌、结肠癌和胰腺癌中激活比例较小。CTA基因的重新表达是肿瘤生长旺盛的重要标志之一,但该类基因对于肿瘤的具体作用尚不明确。ADAM20属于含去整合素域及金属蛋白酶解聚域（ADAM）蛋白家族,具有跨膜结构和分泌功能,细胞定位锚定于细胞膜,参与细胞粘附及多种细胞表面受体和信号分子蛋白水解的过程。ADAM20在诸多恶性肿瘤中高表达,如甲状腺癌、结直肠癌等,并且可能作为MYCT1的靶基因,在其下游发挥癌基因的作用,在肿瘤的始动阶段激活肿瘤细胞活性及生物学功能。因此,对于ADAM20基因的研究有助于发现喉癌发生发展的机制及癌症治疗的潜在靶点,对于喉癌的临床诊疗具有重要意义。Real-time PCR结果表明,在Hep-2细胞中过表达MYCT1可以下调ADAM20m RNA表达水平,提示MYCT1能够负向调控ADAM20基因表达,但是具体分子机制仍未知。结合本课题组前期研究,我们关注到MYCT1下游基因miR-181a,可能参与调控ADAM20转录,参与喉癌的发生发展及生物学功能。microRNAs（miRNAs）是内源性非编码RNA,其存在具有保守性,长度约为21-23个核苷酸,通常认为其参与许多恶性肿瘤发生及发展过程,包括癌细胞的增殖及侵袭转移。micro RNA在肿瘤中发挥的作用可以作为肿瘤诊断和治疗的靶点。在喉癌中,miR-181a发挥抑癌作用,通过转录水平抑制NPM1表达进而促进喉癌细胞的凋亡,然而其作用机制有待进一步研究。本课题组前期研究结果表明MYCT1与MAX结合直接激活miR-181a,在喉癌细胞中具有抑癌作用,抑制喉癌Hep-2细胞增殖,促进喉癌细胞凋亡。通过生物信息学软件预测,miR-181a与ADAM20在上游5’-UTR存在结合位点,可能存在抑制ADAM20转录活性的作用。本研究中,我们拟通过相关分子生物学技术鉴定MYCT1下游基因ADAM20,探究ADAM20在喉癌中的表达及生物学功能,明确MYCT1通过MYCT1/miR-181a/ADAM20调控轴对喉癌细胞生物学功能的影响,有助于发现新的喉癌诊疗分子靶标,具有潜在的临床意义。材料与方法:1、实验材料:人喉癌细胞系Hep-2及人喉癌细胞系TU2122、实验方法:细胞培养、质粒提取、细胞转染、Real-time PCR、Western blot、免疫荧光、Transwell、细胞划痕实验、CCK8检测细胞增殖、克隆形成实验、双荧光素酶报告基因活性检测及统计分析。结果:1、对MYCT1下游基因进行蛋白芯片分析并鉴定,Real-time PCR及Western Blot结果显示ADAM20在MYCT1下游表达量减少（P<0.05）。2、Real-time PCR及Western Blot结果显示,过表达MYCT1后,ADAM20表达水平降低;敲减MYCT1后,ADAM20表达水平升高（P<0.05）。3、免疫荧光结果显示,ADAM20主要表达存在于细胞膜,部分存在于细胞质中;MYCT1主要表达于细胞质中,部分表达于细胞膜,二者具有胞内共定位,且当过表达MYCT1时,ADAM20表达水平降低;当敲减MYCT1后,ADAM20在细胞膜上的表达增加（P<0.05）。4、CCK8与克隆形成实验结果显示,敲减ADAM20显著降低喉癌细胞增殖活性（P<0.05）。5、Transwell与细胞划痕愈合实验结果显示,敲减ADAM20显著降低喉癌细胞迁移能力（P<0.05）。6、生物信息学网站UCSC及JASPAR预测,MYCT1下游靶基因miR-181a可能与ADAM20上游5’-UTR存在潜在结合位点,Real-time PCR结果显示,转染miR-181a mimics显著降低喉癌Hep-2细胞中ADAM20 m RNA表达水平（P<0.05）。7、荧光素酶报告基因结果显示,miR-181a能够显著降低ADAM20基因转录活性（P<0.05）。8、CCK8与克隆形成实验结果显示,与对照组相比,抑制MYCT1或miR-181a表达可以促进喉癌细胞增殖,且敲减ADAM20可以恢复MYCT1及miR-181a对于喉癌增殖能力表型的影响（P<0.05）。9、Transwell与细胞划痕愈合实验结果显示,与对照组相比,抑制MYCT1或miR-181a表达可以促进喉癌细胞迁移,且敲减ADAM20可以恢复MYCT1及miR-181a对于喉癌迁移能力表型的影响（P<0.05）。结论:1、ADAM20在喉癌细胞中异常激活,表达量升高,发挥癌基因作用,且受到MYCT1的负向调控。2、miR-181a直接抑制ADAM20转录活性。3、在喉癌细胞中,MYCT1通过激活miR-181a转录抑制ADAM20的表达,进而影响喉癌细胞增殖及迁移的生物学功能。