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甘蓝(Brassica oleracea L.)和芥菜(Brassica juncea Coss.)都是我国普遍种植的蔬菜作物。均属于十字花科芸薹属,它们必须通过低温春化处理才能生长开花。其中,芥菜属于种子春化型即种子处在萌动状态,就能感受低温的诱导；而甘蓝为绿体春化型,即植株幼苗需长到一定大小,积累一定营养物质后,才能感受低温的诱导。种子春化型植物与绿体春化型植物的区别是感受低温的部位不同：种子萌发时感受低温的部位是胚,而营养体时期的感受部位为茎尖。开花是植物体从营养生长转向生殖生长的过渡阶段,标志着植物即将完成整个生命过程。开花时间的前移或推后,会在生产上、育种上和F1代制种上给植物带来许多不利的因素。因此,研究甘蓝、芥菜抽薹开花的调控机制,在生产上对扩大面积栽培和选育优质品种上都具有十分重要的意义。影响甘蓝、芥菜抽薹开花的调控途径与拟南芥相似,它们均受春化途径、光周期途径、赤霉素途径、自主途径和温敏途径等多条路径的调控。这些途径涉及到的多种开花调控信号,最终汇入到开花途径整合子FLOWERING LOCUS T (FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOCl)。整个花期调控网络中处于核心位置的两个典型MADS蛋白FLOWERING LOCUSC(FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP),通过相互作用形成二聚体抑制开花信号整合子的表达,使抽薹开花延迟。目前,在种子春化型植物拟南芥、芥菜,绿体春化作物型甘蓝中均证实了FLC与SVP蛋白之间能发生相互作用形成聚合复合体。但是,前人的研究报道只表明在同源植物中FLC与SVP存在互作,对来源于不同作物的FLC与SVP之间的是否存在蛋白互作还未见报道。为阐明种子春化作物芥菜BjSVP与绿体春化作物甘蓝BoFLC异源蛋白互作机制。本试验以芥菜‘QJ’和甘蓝‘ZQ’为实验材料,克隆了BoFLC, BjSVP及BjSVP截短体(BjSVP～BjSVP11),利用酵母双杂交技术分别构建了全长BoFLC、BjSVP及BjSVP截短体的酵母重组载体,对绿体春化作物甘蓝BoFLC与种子春化作物芥菜BjSVP之间的相互作用进行分析、筛选并鉴定该蛋白互作的主要结构域。1、全长BoFLC、BjSVP及BjSVP截短体的克隆与分析根据FLC与SVP基因的结构特点和识别特性,设计特异性引物,以甘蓝‘ZQ’和芥菜‘QJ’材料的茎尖反转录cDNA为模板,进行PCR扩增克隆出BoFLC与BjSVP的全长基因,基因片段大小分别为625bp、757bp,分别编码197、241个氨基酸残基。菌液PCR、酶切及测序结果表明,全长基因的序列正确。以pEAST-Blunt Simple-BjSVP质粒为模板,用特异性引物亚克隆BjSVP截短体(BjSVP1～11),其分别编码95、173、78、179、146、111、86、80、64、52和33个氨基酸。菌液PCR、酶切及测序结果表明,截短体的序列正确。2、全长BoFLC与BjSVP相互作用的鉴定利用酵母双杂交系统,将构建的诱饵质粒PGBKT7-BoFLC、猎物质粒PGADT7-BjSVP的酵母表达载体分别转化至酵母菌株Y2HGold、Y187中。Y2HGold的活性比Y187的强,得到酵母转化子Y2HGold(pGBKT7-BoFLC)、Y187(pGADT7-BjSVP),在缺陷型选择性培养基进行鉴定,发现菌落生长正常,表明无自激活和毒性现象。融合后的二倍体酵母Y187(pGADT7-BjSVP)×Y2HGold(pGBKT7-BoFLC)能在选择型培养基SD/-Leu/-Trp/AbA(DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)上正常生长。且在QDO/X/A培养基上长出的菌落呈蓝色。结果表明从芥菜中克隆到的全长SVP能与从甘蓝中克隆得到的FLC蛋白相互聚合形成二聚复合体,激活了酵母中的4个报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1的表达。3、BoFLC作用于BjSVP结构域的筛选及鉴定将分别编码蛋白结构域MI、MIK、K、IKC、KC、IK、IK1L1K2L2、IK1L1K2、 IK1L1、IK1、I的11个BjSVP截短体(BjSVP1～BjSVP11)与酵母表达载体PGADT7结合,构建酵母表达猎物重组质粒pGADT7-BjSVP1～pGADT7-BjSVP11并转化酵母菌株Y187。得到酵母转化子Y187(pGADT7-BjSVP1-11),经过缺陷型选择性培养基的鉴定,发现无自激活和毒性现象产生。融合后含二倍体的重组酵母菌只有Y187(pGADT7-BjSVP2～6)×Y2HGold(pGBKT7-BoFLC)杂交组合能在选择型培养基QDO/X/A上长出正常蓝色菌落。结果表明,截短体BjSVP2～BjSVP6能与BoFLC发生相互作用,而BjSVP1、BjSVP7～BjSVP11则不能与BoFLC互作。由此可知BjSVP完整的K域(BjSVP3)可独立作用于BoFLC,但缺失突变K域亚域(K1、K2、K3)或者连接区(L1、L2)任意一部分后都不能介导该作用。作用强度的分析表明：BjSVP的Ⅰ域能增强该蛋白相互作用,但M域和C域可能会干扰或减弱该互作。