矽肺病(Silicosis)是在生产过程中长期过量吸入含有较高浓度的结晶型游离二氧化硅(silicondioxide,SiO2)粉尘引起的以肺组织不可逆性纤维化为主的全身性疾病,是我国最严重的职业病之一。矽肺病患者早期临床症状较轻或不明显,随着病情的发展可出现咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、胸闷等临床表现。矽肺的基本病理改变是矽结节的形成和肺间质的广泛纤维化。大量的研究也表明其病理机制可能有上皮组织化生与凋亡、纤维母细胞的募集、成纤维细胞的增殖并转化为肌成纤维细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积等。由于矽肺病的发病机制并未完全清楚,目前尚无特效治疗方法。但随着科学的发展和研究的深入,越来越多的证据表明microRNAs(miRNAs,miRs)和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在纤维化疾病(包括矽肺病)的发病过程中发挥着至关重要的作用。EMT是具有极性且相连的上皮细胞转化为非极性且缺乏细胞间连接的间充质细胞的过程,这一过程可以增强细胞的运动性或迁移性。在促纤维化细胞因子的作用下,肺泡II型上皮细胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cells,AT2)会通过EMT的过程转化为肺间质细胞,如成纤维细胞和肌成纤维细胞等,从而促进纤维化的发展。在发生EMT过程中,上皮细胞也逐渐失去上皮表型(丢失上皮标志物如E-cadherin、ZO-1等的表达),并逐渐获得间充质细胞的表型(表达间充质细胞标志物如α-SMA、vimentin等)。miRNAs是一系列长度为18-22个核苷酸的小的非编码RNAs。其生物学功能主要是通过靶定基因的3’-非编码区(3’-untranslatedregion,3’-UTR),抑制其靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA)的翻译或降解,从而调节基因的表达。越来越多的研究表明在肺纤维化过程中,miRNAs可以通过靶定纤维化相关基因或EMT相关基因,发挥促进或抑制纤维化的作用。长链非编码 RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过 200个核苷酸序列的非蛋白编码转录子。大量的研究证实lncRNAs可以调节细胞的增殖分化、转移以及EMT过程。近年来研究lncRNAs功能最多的是其可作为miRNAs的分子"海绵"吸附miRNAs,从而可以调控miRNAs的活性。具有"海绵"吸附功能的lncRNAs也被人命名为竞争性内源RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)。已有研究表明lncRNAs可以通过调节miRNAs的表达在小鼠肺纤维化模型中调控EMT的过程。我们之前的芯片研究发现miR-503在矽尘诱导的肺纤维化组织中的表达降低,并在后续的验证实验中得到了证实,在动物水平上调miR-503可明显抑制矽尘诱导的肺纤维化。为了探讨miR-503减轻矽肺纤维化的作用机制,我们利用小鼠矽肺体内模型以及支气管与肺泡上皮细胞(HBE和A549)的体外模型,研究miR-503在矽肺纤维化中影响上皮间质转化的机制及其调控因素。目的:通过建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化体内模型、细胞体外模型,以及在体内和体外模型中进行miR-503的干涉,探讨miR-503抑制矽尘诱导的肺纤维化可能的分子机制,为miRNA在矽肺病治疗中的应用提供理论依据。方法:(1)建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型:设立空白对照组、生理盐水组以及不同时间点(7天、14天、28天)的矽尘组,以气管内灌注生理盐水粉尘悬浊液的方法建立小鼠矽肺模型,通过肺组织病理切片HE染色观察小鼠肺纤维化病变的变化过程。(2)利用SiO2粉尘悬浊液处理HBE和A549细胞建立体外模型,显微镜观察细胞形态改变。(3)qRT-PCR法检测体内和体外模型中不同时间和浓度下组织和细胞中miR-503表达的改变;Western blot法检测体内和体外模型不同时间和浓度的组织和细胞中EMT标志物(上皮标志物:E-cadherin;间充质标志物:vimentin、α-SMA)表达的改变,使用免疫荧光观察SiO2处理的HBE细胞中α-SMA表达的改变。(4)使用agomir-503或miR-503 mimic联合矽尘分别构建miR-503干预的小鼠动物模型和HBE、A549细胞模型,肺组织切片的HE染色观察小鼠肺组织的纤维化程度,使用qRT-PCR法检测肺组织和细胞中miR-503的表达水平,使用Western-blot法检测肺组织和细胞中EMT标志物表达的改变。(5)通过生物信息学软件预测结合文献选取了 miR-503的靶基因PI3K p85,并通过双荧光素酶报告基因实验证实两者的结合;通过siRNA干涉PI3K p85的表达,使用Western blot法检测其敲除效率和下游分子Akt、Snail的表达以及EMT标志物表达的改变情况。(6)通过回复实验,在HBE和A549细胞中同时转染miR-503 mimic和PI3Kp85的过表达质粒进一步证实两者的调控关系,使用Western blot法检测PI3K p85、下游分子Akt和Snail以及EMT标志物表达的改变。(7)通过生物信息学软件预测到lncRNAMALAT1可能与miR-503存在结合,利用RNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验证实两者的结合;在细胞中使用siRNA敲除lncRNAMALAT1,通过qRT-PCR检测敲除效率及敲除lncRNAMALAT1后miR-503表达的改变,Western blot法检测敲除lncRNA MALAT1后miR-503的靶基因PI3K p85,下游分子Akt、Snail及EMT标志物表达的改变。结果1.小鼠矽肺组织中miR-503的表达降低病理切片HE染色结果显示,随着染尘天数的增加,纤维化的严重程度也逐渐增加,在第14天时有较小的矽结节产生,在第28天时即出现典型的"葱头样"矽结节。Western blot肺组织的检测结果也发现随着染尘时间的延长上皮标志物E-cadherin的表达逐渐降低,而间充质标志物vimentin和α-SMA的表达逐渐升高。对肺组织的qRT-PCR检测结果显示随着染尘时间的增加,肺组织中miR-503的表达水平逐渐降低。2.在小鼠体内升高miR-503可以减轻EMT病理切片的HE染色结果显示高表达miR-503组纤维化的严重程度相比于miR-NC对照组明显减轻,所有病理切片的纤维化评分结果也显示无论是严重程度还是分布范围,高表达miR-503组相比于miR-NC对照组都明显降低,且具有统计学意义。Western blot检测结果显示高表达miR-503可以升高上皮标志物E-cadherin的表达,降低间充质标志物vimentin和α-SMA的表达。这也提示miR-503在矽尘诱导的肺纤维化中在一定程度上可以减轻EMT。3.miR-503通过靶向PI3K p85抑制EMT探究miR-503抑制EMT的作用机制,通过多种生物信息学软件预测到PI3Kp85存在与miR-503结合的潜在结合位点,并且也有文献证实PI3K p85与EMT有关。双荧光素酶报告基因实验发现miR-503只能降低PI3Kp85野生型质粒组的荧光素酶活性,从而证实了两者的结合。Western blot检测结果也显示PI3K p85的表达水平与miR-503的表达水平呈负相关关系;用siRNA敲除PI3Kp85可以逆转EMT过程;同时转染miR-503 mimic和PI3Kp85的过表达质粒的回复实验结果显示过表达PI3Kp85可以逆转miR-503对于EMT的抑制作用。4.miR-503通过调控PI3K/Akt/Snail信号通路影响EMT进一步探索miR-503-PI3K p85影响EMT的信号通路,通过阅读EMT通路相关文献,选取了 PI3K p85的下游分子Akt和Snail进行研究。Western blot结果显示,在小鼠矽肺模型以及细胞模型中,随着染尘时间和染尘剂量的增加p-Akt和Snail的表达逐渐增加;在高表达miR-503的体内和体外模型以及敲除PI3Kp85的细胞实验中,p-Akt和Snail的表达也受到抑制;回复实验发现过表达PI3Kp85可以逆转高表达miR-503对p-Akt和Snail的抑制作用。5.lncRNA MALAT1通过吸附miR-503调节EMT探索miR-503受调控及在矽肺中表达降低的因素。通过生物信息学软件预测到lncRNA MALAT1与miR-503存在潜在结合位点。qRT-PCR检测结果显示在矽尘处理的HBE和A549细胞中lncRNA MALAT1的表达升高,与miR-503的表达趋势相反。RNA pull-down和双荧光素酶报告基因结果提示miR-503与lncRNAMALAT1之间存在结合。使用siRNA敲除lncRNA MALAT1,qRT-PCR结果显示抑制lncRNA MALAT1的表达可以升高miR-503的表达;Western blot结果也显示敲除lncRNA MALAT1可以抑制PI3K p85、p-Akt和Snail的表达水平并逆转EMT过程。提示在矽肺中lncRNA MALAT1可以作为miR-503的"海绵"吸附miR-503,从而降低其表达水平。结论:以上结果提示miR-503可以抑制矽尘诱导的肺纤维化,其机制主要是通过靶向作用于PI3Kp85,减弱了 Akt/Snail信号转导从而抑制上皮细胞发生EMT。此外我们也发现lncRNA MALAT1作为分子"海绵"可吸附miR-503,降低miR-503的表达,从而进一步影响下游PI3Kp85/Akt/Snail信号通路,进而导致EMT,促进矽尘诱导的肺纤维化。