一、研究背景脓毒症(sepsis)的发病机制是机体一种失控的全身性炎症反应,是一种复杂的临床综合征,表现为各种炎症介质的过度释放,引起广泛的细胞和组织损伤,进一步可导致脓毒性休克、严重脓毒症甚至多器官功能障碍综合征。而肾脏是脓毒症发生和发展过程中最易受到损伤的器官,急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是最常见的并发症之一,是死亡的独立危险因素。近年来的研究进一步认识了脓毒症AKI的发生机制包括:肾微循环障碍导致肾脏灌注不足,肾小球周的毛细血管网循环失调,炎症标志物与氧化应激增加对肾小管的毒性作用,级联反应的激活和器官高代谢反应至致细胞死亡等。在这些发病机制中,级联放大的炎症反应在脓毒症AKI中起着举足轻重的作用。Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是最早研究肝癌时发现的一种酪氨酸蛋白激酶基因表达产物,Tec家族和其他两个主要的酪氨酸蛋白激酶家族(Src、Syk激酶家族)被证实与炎症反应相关。Tec激酶家族的Tec、Src被证实在炎症反应中的早期即有激活并磷酸化,其活化亦可能与TLR早期活化相关,对Tec激酶家族的干预试验已被用于一些自身炎症性疾病如类风湿性关节炎等。Tec激酶在脓毒症所致的全身炎症反应中所发挥的机制目前研究甚少,一些研究认为Tec非受体型激酶参与了感染导致脓毒症的过程,并且认为干预Tec激酶的治疗可能是改善感染所致脓毒症的新的靶点。在脓毒症AKI的发生和发展过程中,Tec激酶的表达情况以及Tec激酶是否参与脓毒症AKI的发生及其可能的机制,目前罕有文献报道。本研究部分旨在制造脓毒症急性肾损伤模型,并且了解Tec激酶的肾内表达情况,初步探讨Tec激酶是否参与脓毒症AKI的过程及其可能机制。二、研究目的1.在体内实验中,通过LPS诱导脓毒症AKI模型的建立,研究Tec激酶在AKI肾组织中的表达变化,采用Tec激酶抑制剂进一步研究对AKI肾功能的影响以验证其与AKI发生发展的相关性。同时了解不同组别之间肾组织TLR4、MYD88的表达、NF-κB通路活化情况及肾间质巨噬细胞浸润来探讨Tec激酶在AKI的可能作用机制。2.体外实验中观察Tec激酶在LPS刺激诱导RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子的影响;并通过使用Tec激酶抑制剂和其si RNA后了解其对炎症介质的分泌和MAPK和NF-κB通路活化的影响,期望通过上述研究进一步认识Tec激酶在脓毒症AKI的发生发展中的可能机制,为AKI的治疗提供新的靶点。三、研究内容第一部分脓毒症小鼠AKI中Tec激酶蛋白的表达变化健康雄性清洁级成年C57BL/6小鼠32只,分2组,每组16只,LPS组给予LPS腹腔注射20mg/kg,正常对照组给予等量溶媒,分别于1h、6h、24h、48h每组4只小鼠,麻醉后心脏取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分离肾脏组织,病理学HE染色观察组织结构,免疫组化观察Tec激酶表达,Western blot观察Tec激酶、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达变化。第二部分Tec激酶蛋白抑制剂LFM-A13对脓毒症小鼠AKI的保护作用健康雄性清洁级成年C57BL/6小鼠36只,分6组,每组6只,LPS组给予LPS腹腔注射20mg/kg,正常对照组给予等量溶媒,LPS+LFM-A13(40mg/kg)、LPS+LFM-A13(60mg/kg)、LPS+LFM-A13(80mg/kg)组分别在给予LPS20mg/kg腹腔注射后立即并分次给予LFM-A13(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)腹腔给药,LFM-A13组仅给予LFM-A13(60mg/kg)腹腔给药,并补足小鼠腹腔灌注液体体积为1ml/20g,造模后24小时,小鼠麻醉后心脏取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分离肾脏组织,病理学HE染色观察组织结构,免疫组化观察Tec激酶表达,巨噬细胞浸润,Western blot观察Tec激酶、myd88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达变化。培养大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E,分别以不同浓度的LPS(0ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激,再以0.1ug/ml LPS刺激NRK-52E细胞不同时间(0min、15m、30min、60min、120min),提取细胞蛋白,Western blot检测Tec激酶表达状况。再观察抑制剂的体外效果,LPS(0.1ug/ml)并加用不同浓度LFM-A13(50u M、75u M、100u M)预处理1h,提取细胞蛋白,Western blot检测Tec激酶表达状况。第三部分抑制Tec激酶蛋白表达对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞促炎性细胞因子产生的影响及机制培养巨噬细胞RAW264.7,加用抑制剂LFM-A13(25u M、75u M)预处理RAW264.7细胞1h,并0.1ug/ml LPS刺激1h,流式细胞术、q RT-PCR的方法检测RAW264.7细胞上ICAM-1的表达水平,提取细胞蛋白,western blot检测IκBα、NFκB-p65的蛋白表达及磷酸化水平及TAK-1的磷酸化水平,激光共聚焦检测RAW264.7细胞中NFκB-p65核转移状况。Tec激酶si RNA干扰RAW264.7细胞特异性沉默Tec激酶基因表达,并在瞬时转染后给予LPS0.1mg/ml刺激RAW264.7细胞1h,提取细胞蛋白,western blot检测TAK1、p-p38/p38和p-p65蛋白表达。四、研究结果第一部分建立小鼠LPS腹腔注射致脓毒症AKI模型,LPS20mg/kg腹腔内注射后1h即可见肾脏组织的轻度损伤及Cys C升高,6h可见血尿素氮升高,24h肾功能指标均有明显升高,并可见明显的肾脏组织学损害。48h上述肾功能及肾脏组织损伤明显改善。造模后1h即可见血清炎症因子IL-1β和TNF-ɑ明显升高,其中IL-1β在6h时升高最为明显,TNF-ɑ在1h时升高最为明显。造模后1h即可见肾内Tec激酶及TLR4蛋白表达升高,持续致6h后开始下降,与正常对照组相比持续至48h均有升高。造模后6h可见NFκB-p65及其磷酸化水平明显升高。肾组织免疫组化证实在LPS致脓毒症建模后1h即可见肾小管上皮细胞内Tec激酶表达升高。第二部分小鼠腹腔注射LPS 24h后肾功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)明显升高,肾组织损伤明显,抑制剂LFM-A13给药后各个剂量组均能明显改善小鼠肾功能变化,同时明显改善肾脏组织病理损伤。血清ELISA检测提示LFM-A13明显降低脓毒症模型组IL-1β及TNF-ɑ水平。western blot结果提示LFM-A13明显减少脓毒症小鼠肾脏组织Tec激酶、MYD88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表达水平。免疫组化染色提示LFM-A13明显减少肾小管上皮细胞内Tec激酶的表达,并明显减少脓毒症小鼠肾内巨噬细胞浸润。体外实验示浓度梯度LPS刺激大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E,0.1mg/ml即可见Tec激酶蛋白表达升高。时间效应观察0.1ug/ml LPS刺激大鼠肾小管上皮细胞后30min即可见Tec激酶表达的升高,持续升高致120min,抑制剂LFM-A13(50u M、75u M、100u M)可以明显减少Tec激酶的表达。第三部分流式细胞术、q RT-PCR显示LFM-A13减少LPS刺激后RAW264.7细胞ICAM-1的产生。Western blot示LFM-A13(25u M、75u M)下调LPS刺激RAW264.7细胞后NFκB-p65及TAK1的活化;LPS刺激促进了RAW264.7细胞胞浆内IκBα蛋白的磷酸化降解和NFκB-p65的核转移,进而激活NFκB信号转导通路的活化,而Tec激酶抑制剂LFM-A13预处理则明显能抑制NFκB信号通路的活化,并明显减少NFκB-p65的核转移。Tec si RNA(Tec mus-790 RNAi)选择性沉默Tec激酶m RNA表达后可明显下调LPS刺激RAW264.7细胞内p-p38/p38、p-p65、p-TAK1/TAK1蛋白的表达水平。五、研究结论1.采用LPS(20mg/kg)腹腔内注射后1h即可检测出炎症指标的明显升高,并出现早期肾功能损伤,以24小时最为明显,其后呈现修复趋势。脓毒症AKI小鼠肾脏组织极早期便可检测出Tec激酶的高表达,并伴随TLR4通路蛋白及下游细胞因子NFκB-p65的表达及活化水平的升高,提示Tec激酶参与了脓毒症AKI的早期启动过程,并可能通过参与脓毒症致炎症损伤机制而发挥作用。2.LPS刺激的小鼠脓毒症模型其肾脏组织中存在Tec激酶蛋白的过高表达,并在肾小管上皮细胞中存在过高表达。LFM-A13在体内及体外均能够抑制肾小管上皮细胞中Tec激酶蛋白过高表达,并可能通过抑制TLR4/MYD88信号通路,抑制NFκB-p65的活化,减少炎症因子产生及巨噬细胞浸润等机制发挥防治AKI的作用,改善肾功能损伤及肾脏组织病理损伤。3.LFM-A13预处理RAW264.7细胞以及si RNA沉默Tec激酶基因表达后,可抑制LPS刺激的Tec激酶过高表达,并可能通过抑制TAK1通路干扰NFκB信号通路的活化并减少炎症因子的释放,从而发挥其在巨噬细胞中的抗炎作用。