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类风湿性关节炎(RA)是一种以侵犯关节滑膜为特征的自身免疫介导的慢性炎症性免疫疾病,临床上给病人带来巨大痛苦,且治疗周期长,易复发,严重降低患者生活质量,增加社会经济负担。由于其多因素共同作用的复杂致病机理,目前关于RA的发病机制尚未明确。因此寻找RA潜在的生物标志物,揭示其细胞分子致病机制对提高RA的临床诊断及开发早期干预和预防手段尤为重要。大量研究显示,miRNA作为重要的转录后调控因子,对RA发病过程中的相关免疫炎症反应发挥着重要的作用。鉴于此,本研究将从以下两个章节鉴定RA相关miRNA关联网络和调控网络,并对miRNA与RA相关的细胞分子功能机制进行深入研究。第一章:运用高通量基因芯片表达谱技术筛选RA外周血单个核细胞中差异表达的miRNA和mRNA,构建RA相关miRNA的靶基因调控网络,运用生物信息学等方法进行生物通路和基因富集分析,并在独立人群样本中对RA相关miRNA进行验证,评价RA潜在miRNA生物标志物的RA评判价值;第二章:构建RA相关miR-99b-5p前体miR-99b过表达重组慢病毒载体,检测感染慢病毒的Jurkat T淋巴细胞中RA相关炎症细胞因子及miRNA相关靶基因的表达,利用细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期检测实验研究miR-99b与RA相关的细胞分子功能机制。第一章研究目的基于高通量芯片测序技术系统筛选外周血单个核细胞中RA相关miRNA生物标志物,并构建miRNA与下游靶基因的调控网络。研究方法提取RA病例组和健康对照人群的外周血单个核细胞,运用高通量表达谱芯片技术筛选RA相关的差异表达的miRNA和mRNA,构建miRNA与下游靶基因的调控网络。同时利用生物通路/基因富集分析和蛋白间相互作用研究,对miRNA相关靶基因进行生物信息学分析,并结合因果推论分析筛选出miRNA参与RA发病的潜在作用靶标及分子信号通路。在另一独立的大样本人群中对差异表达的miRNA进行RT-PCR验证。最后运用ROC曲线评价RA潜在miRNA生物标志物的疾病评判价值。研究结果在研究收集的25例RA活动期患者和18例健康对照的外周血单个核细胞中筛选得到18个RA相关的差异表达的miRNA,其中17个为新发现的RA相关的miRNA。通过对miRNA进行靶基因预测和计算miRNA与靶基因间的皮尔逊相关系数,构建RA相关miRNA的下游靶基因调控网络。独立人群样本的RT-PCR实验验证了 hsa-miR-1184和hsa-miR-99b-5p在RA外周血单个核细胞中的表达变化。因果推论研究发现hsa-miR-99b-5p能通过作用靶基因mTOR调节细胞因子信号转导IL6ST,进而导致RA的发病,但未发现hsa-miR-1184参与影响的RA发病的分子信号通路。生物通路/基因富集分析和蛋白间相互作用分析结果也显示mTOR是影响RA发病的潜在易感基因。ROC曲线研究显示hsa-miR-1184和hsa-miR-99b-5p作为RA疾病的潜在评判指标,具有较好的特异度和灵敏度,两者的联合使用能进一步提高RA的判别能力。研究结论通过运用高通量表达谱芯片技术,研究共筛选得到18个RA相关的miRNA生物标志物,其中17个为新发现的miRNA标志物。基于miRNA的RT-PCR验证结果、因果推论分析和靶基因的生物信息学分析结果等证据,hsa-miR-99b-5p作为RA潜在的表观遗传生物标志物,对RA疾病的发生发展发挥重要的调控作用,可针对其展开进一步的分子功能机制研究。第二章研究目的基于第一章已有证据,围绕miR-99b-5p开展其对Jurkat T淋巴细胞的生物学特性影响研究,以期阐明miR-99b-5p与RA相关细胞的分子功能机制。研究方法构建RA相关miR-99b-5p前体miR-99b过表达重组慢病毒载体及阴性对照,通过RT-qPCR方法检测感染慢病毒后的Jurkat T淋巴细胞中RA相关炎症细胞因子及miR-99b相关靶基因的表达,同时在RA独立人群样本中对miR-99b-5p相关靶基因及细胞因子进行表达检测。运用CCK-8细胞增殖毒性检测方法、Annexin V/PI双染法及PI染色的细胞周期检测方法对感染miR-99b过表达慢病毒的Jurkat细胞分别进行细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的检测。研究结果RA人群样本的RT-PCR结果显示miR-99b-5p的靶基因mTOR及细胞因子信号转导IL6ST在人外周血单个核细胞中显著低表达。而在miR-99b重组慢病毒载体感染的Jurkat细胞中,靶基因mTOR变化不明显但所在信号通路的AKT1表达水平明显降低,细胞因子IL-2、IL-6、IL6ST、IFN-γ显著低表达而TNF-α的表达水平明显升高。此外,高表达的miR-99b会抑制Jurkat细胞的凋亡,促进其增殖活性。研究结论miR-99b可能通过靶向负调控AKT/mTOR信号通路,降低Jurkat细胞内RA相关细胞因子(如IL6及其信号传导IL6ST)的表达,促进促炎细胞因子TNF-α的分泌,从而对T细胞的生长活化发挥重要作用,引起RA相关的免疫炎症反应。