口服免疫是一种简单而有效诱导粘膜免疫的免疫方式,但由于缺乏良好的运输系统和吸收系统,很大程度上限制了口服疫苗的发展。大肠毒素不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一个强有力的调节免疫的信号和载体分子,因而通常被作为佐剂应用于口服疫苗。为了研究LTB对罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫增强效果,本研究通过对已构建的LTB重组酵母进行诱导表达,探索重组LTB最佳表达时间并检测其安全性,并建立罗非鱼抗体检测间接ELISA方法,为罗非鱼抗体的检测奠定了基础,最后将LTB与链球菌口服疫苗联合口服免疫罗非鱼,研究LTB对罗非鱼的免疫增强效果,为链球菌口服疫苗免疫佐剂开发利用提供数据参考。本实验通过对已构建的重组LTB KM71毕赤酵母进行诱导表达以及LTB毒性实验,探讨重组LTB的最佳表达时间以及表达量,检测了LTB对罗非鱼的安全性。实验显示,重组LTB在毕赤酵母中得到有效表达,最佳的表达时间为96h,表达量为2.716mg/mL。LTB对罗非鱼在灌胃初期具有轻微刺激性,但能够作为罗非鱼肠道粘膜佐剂使用。在罗非鱼血清及粘膜抗体水平间接ELISA检测方法建立的实验中发现,罗非鱼血清抗体间接ELISA检测的最佳反应温度为22℃,抗原包被浓度为5.5μg/mL,待测血清、多抗的稀释度和酶标二抗的稀释度分别为1/400、1/2000和1/8000。在对LTB的免疫增强效果研究的试验中,以罗非鱼链球菌口服疫苗0.2×109cells/尾、0.2×108cells/尾和0.2×107cells/尾三个口服剂量水平以及LTB口服剂量1.68μg／尾、0.84μg／尾和0.17μg／尾3个处理水平设计联合疫苗,并通过口服免疫罗非鱼,评价LTB的免疫增强效果及联合疫苗相对保护率。结果表明,LTB能够促进血清以及肠道粘膜抗体水平,对链球菌口服疫苗有佐剂效应。当疫苗口服剂量为0.2×108cells/尾,LTB口服剂量为0.84μg／尾的组合时达到最佳免疫效果,该组合能在免疫后期稳定持续高效的提高血清和肠道粘膜抗体应答水平,并且使罗非鱼在免疫后第10d、20d和30d相对保护率分别达到65.00%、68.42%和64.71%。肠道粘膜抗体水平和LTB的含量成正比,但在免疫期内同一LTB含量实验组的抗体水平波动幅度较大。检测LTB对罗非鱼非特异性免疫效应的影响,发现LTB可显著提高溶菌酶和碱性磷酸酶水平,对酸性磷酸酶无显著影响,但对超氧化物歧化酶表现出抑制作用。实验结果表明,LTB虽然对罗非鱼灌胃前期具有微弱刺激性,但总体可提高鱼体的免疫力,与罗非鱼链球菌口服疫苗联合时,可明显提高50g～60g罗非鱼链球菌口服疫苗的免疫效果,提高血清和肠道粘膜免疫水平,是一种具有潜力的口服疫苗免疫佐剂。