血吸虫病是一种历史悠久、分布面广、对人类健康危害严重的人兽共患寄生虫病。目前流行于亚洲、非洲和美洲的74个国家，受威胁人口达6亿，2亿人受感染。血吸虫疫苗是控制血吸虫病的重要补充途径，因而是血吸虫病防治研究的热点。粘膜是机体免疫的第一道防线。与非粘膜免疫比较，粘膜免疫(如经口、滴鼻等)除可引起机体产生全身免疫应答(包括细胞免疫和体液免疫)外，还可诱导产生粘膜免疫应答(sIgA)，从而有效地提高机体的免疫保护力。研究业已表明粘膜免疫参与了血吸虫的保护性免疫应答，植物基因工程疫苗具有通过食用(口服)接种诱导粘膜免疫应答等优点。本研究以日本血吸虫铁蛋白基因为目的基因，探讨油菜作为日本血吸虫口服疫苗的载体的可能，为血吸虫疫苗和口服疫苗载体的研究提供新的思路。1．日本血吸虫铁蛋白基因(SjFer)的克隆、表达和抗血清的制备：雌性昆明鼠10只，30g，经腹部贴壁感染40条日本血吸虫尾蚴，42天后处死门静脉冲虫取成虫，经液氮粉碎，提取RNA，制备cDNA文库。根据GenBank中SjFer序列设计特异性引物一对，以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板PCR扩增SjFer，将其插入到pMD18-T Simple vector中，经测序比较，发现该序列与GenBank中日本血吸虫铁蛋白基因序列(AF040385)具有100％同源性。将SjFer定向克隆到pET32α(+)中，构建重组质粒SjFer／pET32α(+)，将重组质粒转化大肠杆菌BL21，提取质粒经PCR、双酶切和测序，鉴定插入片段正确后，经终浓度为1mmg／L的IPTG诱导，提取重组蛋白rSjFer，SDS-PAGE电泳分析显示表达的融合蛋白为42kD，与预期结果一致。western-blotting鉴定呈阳性，说明该蛋白具有免疫活性。用8M尿素纯化该融合蛋白并复性，与弗氏完全佐剂(第二开始使用弗氏不完全佐剂)等体积混匀，按0-2-4周皮下免疫小鼠。第三次免疫后15天ELISA方法检测抗体效价。得到效价为1：6400的抗血清。2．日本血吸虫铁蛋白基因(SjFer)在油菜中表达：根据SjFer序列设计一对特异性引物，用PCR方法从cDNA文库中扩增铁蛋白基因，然后克隆到pMD18-T Simple vector载体中，从T载体中切下目的片段后，定向克隆到pBI121中，重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定以检测插入片段是否正确。利用冻融法直接将重组质粒转入根癌农杆菌LAB4404，挑取阳性克隆进行PCR分析确定后，阳性根癌农杆菌介导转化油菜子叶，经过不同浓度的筛选培养基(含卡那霉素)的筛选和生根培养基中的诱导生根，开瓶锻炼3～5天后移入花盆中，即获得转化植株。提取转化植株的总DNA和RNA，PCR分析显示在约520bp处出现一亮带，说明SjFer已成功转入油菜中；Northern-blot杂交呈阳性，说明SjFer已在转录水平上得到正确的表达。提取转化植株的总蛋白，以日本血吸虫铁蛋白抗血清作为一抗，进行western-blotting活性检测，结果呈阳性，且定位于22kD处，与预期结果一致。可见SjFer已在油菜中正确表达，且具有良好的免疫原性。本研究在构建cDNA文库的基础上，成功地扩增了日本血吸虫铁蛋白基因，并在油菜中实现了表达，且具有免疫活性，该研究为进一步研究日本血吸虫基因工程疫苗奠定基础。