烟草(Nicotianata bacum L.)是世界上重要的经济作物之一,也是分子生物学和基因工程研究中的一种非常经典的模式植物。我国是世界上烟草生产和消费最大的国家,烟草的品质和质量直接关系着我国的财政收入。但目前我国的烟草面临着遗传背景狭窄、亲本材料匮乏等重大问题,严重制约了烟草育种,尤其是低害或无害烟草育种工作的进程。分子标记辅助育种因能显著提高育种效率而成为世界广泛研究和采用的技术。SSR标记技术是众多标记技术中的一种,它起源于上世纪90年代,是一种以PCR为基础的分子标记技术。由于其具有在基因组上数量多、分布均匀、多态性丰富、重复性好以及呈共显性遗传等优点,被广泛应用于生物的遗传研究中。因此,烟草SSR标记的开发,对烟草遗传多样性研究、遗传图谱的构建、重要农艺性状的基因定位、以及分子标记辅助育种等都具有重要的生物学意义。本研究利用NCBI数据库中已有的烟草EST序列以及林烟草和绒毛状烟草的基因组测序结果,鉴定EST-SSR和genomic SSR,比较分析标记的分布频率和特点,进而成功开发并建立了 EST-SSR标记;利用这些EST-SSR标记研究分析了 20份烟草种质资源遗传多样性。主要有以下研究结果:1.明确了烟草EST-SSR标记的分布频率和特点。从NCBI数据库中下载了 429,869条烟草EST序列,用软件CD-HIT剔除冗余序列,最终生成379,967条Uni-EST。共检索到了 38,165条EST-SSR,检出率为10.04%。将非冗余EST序列拼接后得到的总长度为210,809.9kb,平均距离为5.52kb,共包括124种重复基元。其中单核苷酸和三核苷酸重复为主要类型,分别占全部SSR的40.53%和34.51%。在所有的重复基元中,A/T重复基元数目最多,占全部SSR的36.61%;其次为AGC/GCT和AG/CT,分别占14.83%和12.16%。同时,基于林烟草和绒毛状烟草基因组的SSR扫描结果,对EST-SSR和genomic SSR的特点进行了分析比较,为进一步开发EST-SSR标记奠定了理论基础。2.成功建立了烟草EST-SSR标记。将所有的EST-SSR引物在林烟草和绒毛状烟草的基因组上进行比对,获得了唯一匹配到基因组上的EST-SSR引物,同时将这些引物和花色素苷合成相关的类黄酮化合物合成途径以及烟碱转化性状相关基因在烟草基因组上进行排序,获得了基因附近的SSR。共设计了 86对EST-SSR引物,包括48对随机挑选的引物和38对基因附近的SSR引物,在两个重组群体的两对亲本材料中进行筛选,有47对引物可以扩增出目的片段,包括21对基因附近的SSR引物,其中有15对引物表现出良好的多态性,多态性比例为17.44%。3.烟草种质资源遗传多样性研究。利用15对多态性良好的EST-SSR引物对20份不同类型的烟草材料进行了遗传多样性研究。共检测到了 58个等位基因位点,平均每对引物可以扩增出3.86条DNA片段,多态性引物的多态性信息含量(PIC)在0.16-0.71,平均0.54,表现出高水平的多态性。UPGMA聚类结果显示这20份材料的遗传相似系数在0.490-0.93之间,材料间表现出明显的遗传变异。在遗传相似系数为0.49处,可将20份烟草材料分为两大组:黄花烟草聚为一组,普通烟草聚为另一组;在普通烟草组中,香料烟被单独归为一类。但整体来看这些普通烟草之间的遗传相似系数较高,表现出较近的亲缘关系。PCA分析结果显示,在所有的烟草材料中黄花烟草被成功地区分开来,这与UPGMA聚类结果一致。本研究基于烟草EST序列和基因组测序结果,成功开发了 15对多态性稳定且条带清晰的EST-SSR引物,这些SSR标记及开发技术为后续的基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种等研究提供了有用的信息。