大熊猫轮状病毒（Giant Panda Rotavirus,GPRV）主要感染幼龄大熊猫,对大熊猫的繁育、健康及野化放归带来重大威胁。因此,加强GPRV感染的监测和开发简单、快速、高灵敏度的实验室诊断方法成为防控重点。通过对GPRV血清分型的鉴定,分析其流行趋势和遗传进化规律,为疫苗的选择和研发提供基础数据。1.大熊猫轮状病毒环介导等温扩增方法的建立对于病毒检测而言,环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）是快速且灵敏的分子生物学诊断方法,该方法成本低廉、操作简单、不需要高端仪器,还可通过肉眼直接观察结果,但目前还未用于检测GPRV。故本研究根据大熊猫轮状病毒CH-1株VP4基因设计3对引物,建立大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术,对其进行条件优化,检测其特异度、灵敏度,并用所建立LAMP检测方法对2017年至2019年共91份大熊猫粪便样本进行GPRV检测,用荧光定量PCR验证吻合度。结果表明,在扩增体系中加入终浓度为1×可见光染料可实现LAMP检测结果的可视化观察,阳性扩增样品的颜色从紫色变为蓝色,而阴性扩增样品未见颜色变化。当Mg2+浓度为8.0 m M、甜菜碱浓度为0.6 M、Bst DNA聚合酶浓度为12 U时,在62℃反应40分钟后可得到最佳扩增效果。该方法特异性强,对一些常见的大熊猫感染病毒如犬瘟热病毒、细小病毒等无交叉反应;其灵敏度比常规PCR高100倍,最低检测限为50 fg RNA。对2017年至2019年共91份大熊猫粪便样本进行检测,其中39份为GPRV阳性,总阳性率为42.86%,荧光定量PCR验证其阳性符合率为97.50%,阴性符合率为98.08%。2.G/P血清型鉴定及其遗传进化分析本研究通过建立的LAMP检测方法筛选出GPRV阳性的大熊猫粪便样本,采用巢氏PCR方法对阳性样本进行G/P血清型鉴定,分别构建p MD19T-VP7、p MD19T-VP4重组质粒并测序。将测序结果通过BLAST与Gen Bank中已报道的轮状病毒VP4、VP7基因序列进行同源性比对,采用最大似然法（Maximum Likelihood,ML）构建进化树,通过软件分析其平均进化速率和选择压力。结果表明2017年至2019年大熊猫轮状病毒的主要流行血清型为G2P[8],偶有检出G1、G4和P[11]血清型。新的G/P血清型均与GPRV CH-1株VP7、VP4基因同源性均在98%以上,猜测所检出的新血清型为CH-1株进化导致的血清型改变。VP7和VP4基因的平均进化速率分别为1.93×10-4和1.81×10-4替换·位点-1·年-1。分析其选择压力发现,VP7基因筛选出正向选择位点1个,VP4基因筛选出正向选择位点和负向选择位点各6个,以上正向选择位点的分析对识别免疫逃避、抗药性突变、疾病防治有积极作用,同时VP4基因在适应性进化过程中还承受一定程度的负向选择压力,这种压力能够保证RNA病毒的稳定性。本研究建立了GPRV可视化LAMP检测方法,相较常规PCR,该方法成本低廉、反应快速、特异性强、灵敏度高,荧光定量PCR验证其吻合度可靠,可以作为临床早期快速检测GPRV的有效工具,实现对该病的高效监测。对大熊猫粪便样品进行血清分型鉴定发现,目前的主要流行血清型为G2P[8],通过遗传分析猜测该流行血清型主要由GPRV CH-1株进化导致其血清型改变。掌握GPRV的分子流行趋势,对其进行遗传进化分析,这对疫苗的开发和评估疫苗的应用效果的影响具有重要价值。