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目的:构建胶质细胞源性神经营养因子受体α2基因（GlialCellLine-derived Neurotrophic Factor Receptor2,GFRα2 ）过表达慢病毒载体（Lentiviral vector,LV）,并对其进行病毒包装与鉴定,为进行GFRα2基因体内外实验奠定基础。方法:GenBank搜索GFRα2基因序列（Gene ID:2675,序列号:NM001495）,设计PCR（Real-time PCR）引物扩增目的基因,构建至过表达载体并转化感受态细胞,进行测序验证。成功进行验证后,使其与慢病毒包装质粒混合物共转染人肾上皮细胞293T,并包装为慢病毒,待浓缩纯化后检测其滴度。结果:测序结果与目标序列相一致,PCR鉴定产物大小1536bp,和预期值大小相同,Western blotting技术检测观察到55KD附近处有特征条带,且与目的基因融合蛋白大小一致,结果证实GFRα2正确插入到载体中,且过表达载体构建成功。感染人肾上皮细胞293T细胞后,荧光显微镜下可观察到荧光表达,收集病毒上清液,荧光法测定病毒的包装滴度为2.0×1 08TU/ml。结论:GFRα2基因过表达慢病毒载体构建成功,为研究其在乳腺癌内分泌治疗的生物学功能奠定了基础。目的:构建乳腺癌细胞系MCF-7他莫昔芬耐药细胞株,并对其进行功能验证,探索GFRα2及HER2表达情况与其耐药性的关系。方法:1、4-OH他莫昔芬（OHT）诱导MCF-7乳腺癌细胞,显微镜下观察比较不同诱导时间细胞形态学差异,制作生长曲线,比较细胞生长差异。2、CCK8试剂盒检测药物敏感试验。计算不同诱导时间细胞的半数抑制浓度IC50及耐药指数（RI）。3、细胞侵袭迁移实验比较MCF-7细胞、OHT诱导第14天（MCF-7 14d）及第28天（MCF-7 28d）侵袭迁移能力。4、RT-PCR检测不同诱导时间细胞的GFRα2 mRNA及HER2 mRNA表达情况。Western blot检测GFRα2、HER2蛋白表达情况。结果:1、MCF-7细胞呈铺路石样团簇生长团,形态呈椭圆形,体积中等,大小均匀,核仁清晰;使用OHT诱导7天,细胞团簇样生长开始趋于松散,细胞形态开始出现变化,由圆形、椭圆形逐渐转变为星形、多角形;诱导第14天,细胞松散,团簇样生长不明显,细胞形态明显变化,呈星形、多角形、树枝样;诱导28天后,细胞团簇样生长不明显,形态较扁平,以尖角形或多角形为主,排列无规则,体积较大,核仁大且明显,胞质内杂志较多。2、MCF-7亲本细胞,4-OHT诱导14d、28d各组之间细胞生长速度无明显变化,增殖能力与MCF-7细胞相似。3、随着诱导时间的增加,不同浓度的4-OHT作用下的各组细胞的抑制率均逐渐降低,而IC50和RI均逐渐增高。其中,在诱导第14天时,获得的细胞株MCF-7 14d的IC50、RI达到最高值,并显著高于MCF-7细胞株,说明其耐药性最高。但随着4-OHT诱导时间分别延长至21天和28天时,获得的细胞株MCF-7 21d和MCF-7 28d的IC50和RI均较MCF-7 14d细胞降低,其中诱导至28天时,细胞的IC50趋于稳定。不同浓度OHT对各组细胞株的抑制率存在差异,其中OHT的浓度为10-4 mol/L时,对各组细胞株的抑制率均最高,而浓度为10-8 mol/L时抑制率最低,并且在浓度为10-8mol/L时,OHT对MCF-7 28d细胞无抑制作用。4、MCF-7 28d组的迁移细胞数较另两组细胞均显著增高,差异有统计学意义。表明MCF-7 28d组细胞侵袭迁移能力明显增强。5、使用OHT诱导MCF-7第7天时,获得的细胞MCF-7 7d的GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表达量较MCF-7细胞低;诱导至第14天时,MCF-714d细胞中两者表达水平均明显增高,与亲本MCF-7细胞相比显著增高,差异有统计学意义（P<0.05）。诱导第21天时,两者表达水平不再增高,反而下降。28天时,MCF-7 28d细胞的GFRα2mRNA表达量仍较MCF-7高,差异有统计学意义（P<0.05）,但其HER2mRNA表达却较MCF-7明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。使用Western blot检测MCF-7 14d细胞的GFRα2和HER2蛋白表达情况,结果显示,GFRα2及HER2均有明显条带显示,表明细胞中GFRα2和HER2蛋白有表达。结论:采用高浓度短时间OHT他莫昔芬冲击法诱导乳腺癌细胞株MCF-7,在诱导至第14天时成功构建乳腺癌细胞他莫昔芬耐药细胞株MCF-7 14d。与其他诱导时间的乳腺癌细胞株比较,使用CCK8试剂盒检测结果表明,该耐药细胞株的耐药指数最大,耐药性最强;而RT-PCR检测结果显示,该耐药细胞株中GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表达量最高。提示GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表达状况与MCF-7细胞的他莫昔芬耐药有关,两者的高表达可能增强了 MCF-7细胞对他莫昔芬的抗药性。OHT连续诱导28天,细胞侵袭迁移能力增强