背景:肝细胞癌（HCC）是第六大最常见的癌症类型,也是癌症相关死亡的第三大常见原因,占所有肝癌病例的80%。目前,可以通过手术切除、经导管动脉化疗栓塞（TACE）、射频消融术和肝移植等传统方法治疗HCC。然而,治疗的效果相当有限的。免疫疗法的兴起为肝癌的治疗带来了新的曙光,但现有的免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂也仅对大约30%的HCC患者有效。研究表明这可能跟肝脏中复杂的免疫环境通过多种机制导致肝癌免疫耐受有关。因此,研究肝癌免疫耐受的机制,挖掘新的免疫治疗靶点对肝癌治疗意义重大。目的:肝细胞癌（HCC）是一种典型的炎症驱动性癌症。由长期的慢性肝炎、肝硬化发展而来。慢性炎症使得肝脏中富含多种大量的免疫细胞,其中就有各种先天免疫细胞,这些细胞也构成了人体免疫系统的第一道防线。但就是在这种免疫细胞浸润的微环镜中,肝癌是如何发生的?目前,有关肝癌细胞逃避先天免疫系统监视的机制尚不清楚。因此,本研究的目的是挖掘参与HCC免疫抑制的关键基因,并探索其可能的作用机制。最终目的是为肝癌的治疗提供新的靶点或者方向。方法:1.利用生物信息学分析在TCGA数据库中筛选出肝癌中具有免疫抑制作用的先天免疫相关基因（IIRGs）。通过生存分析和Cox比例风险回归模型构建先天免疫风险基因集,运用单因素和多因素Cox回归分析并绘制受试者工作特性（ROC）曲线得出该基因集对肝癌患者预后评估的价值。然后使用GEO数据库和人类蛋白图谱数据库验证基因表达。另外通过直线相关分析研究筛选出的基因与免疫检查点和免疫抑制性细胞因子的相关性,并运用TIDE工具预测这些基因与免疫检查点阻断治疗疗效的相关性。2.在第一部分的研究基础上,我们发现COLEC12的高表达可能参与了肝癌的免疫耐受,促进了肝癌的发生发展,但其具体的作用机制尚不清楚。为此,本部分研究进一步探讨COLEC12在肝癌中的具体功能及潜在作用机制。首先,采用IHC检测本院肝癌患者的手术切除标本中的COLEC12的表达情况,用q PCR和WB比较肝癌和癌旁组织以及人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株LM03、Hep3B和Huh7中COLEC12的表达,构建si RNA质粒干扰肝癌细胞株Hep3B和Huh7中COLEC12的表达,采用MTT法和Transwell法检测肝癌细胞增殖和迁移/侵袭能力。建立异种移植模型,观察干预COLEC12后对瘤体生长的影响,用IHC和IF检测廇体组织中的表型的改变和先天免疫细胞浸润特点。选用Hep3B和Huh7细胞与PMA激活后的人巨噬细胞THP-1（M0）共培养,观察si-COLEC12组和对照组的肝癌细胞增殖、迁移/侵袭能力,流式细胞术比较两组分别共培养的巨噬细胞M1/M2表型极化的差异。用ELISA检测收集的共培养上清液中免疫相关细胞因子,WB检测与巨噬细胞共培养的Hep3B和Huh7细胞中可能相关的下游信号通路蛋白分子的表达情况。进一步验证COLEC12在肝癌中的免疫抑制作用,并初步探索其潜在的作用机制。3.第二部分的研究对COLEC12可能的下游作用机制进行了探讨,那么COLEC12在肝癌组织中为何会升高呢?它的上游作用机制是什么?为此,本研究将使用大数据和实验研究相结合的方法继续探索引起肝癌中免疫耐受性受体COLEC12表达升高可能的原因。用免疫浸润研究工具Cibersorts和Timer分析比较TCGA数据库中COLEC12和Toll样受体（TLR4）的免疫浸润特点,即分析目的基因COLEC12和TLR4与免疫微环境（TME）中包括中性粒细胞（neutrophil）、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、免疫调节性T淋巴细胞（Treg）、树突状细胞（DCs）、巨噬细胞M0、M1、M2以及NK细胞在内的10种免疫细胞的相关性。用spearman相关分析在TCGA和GTEx数据库中COLEC12和TLR4两个基因之间的表达相关情况以及它们分别和巨噬细胞M1、M2的表型标记物CD86、CD206的表达相关特点。用DIANA tools预测COLEC12和TLR4共同作用的micro RNAs,通过双荧光素酶报告基因实验分析确定了COLEC12、TLR4与mi R-520b之间的相互作用。用敲降和中止复位实验验证COLEC12和TLR4的内源性竞争关系。用IHC检测人肝癌和癌旁组织中TLR4基因的表达情况,再结合与上部分实验中COLEC12在人肝癌标本的IHC结果进行对比分析。比较TCGA、GTEx数据库中肝癌、癌旁组织和正常肝脏组织中COLEC12和TLR4表达情况和这两个基因分别在以上组织中细胞亚群巨噬细胞M1/M2的贡献比例（即免疫激活性和免疫耐受性）。揭示肝癌中COLEC12表达升高背后可能的机制。结果:1.在TCGA中,通过比较肝癌组织与癌旁正常组织,共鉴定出3676个基因表达差异m RNA。差异基因基因组富集分析显示,在3个先天免疫反应相关基因（IIRGS）集共383个基因中,有21个IIRGs在肝癌组织中高表达。通过生存分析和Cox比例风险回归模型构建先天免疫风险特征集,包3个IIRGs:C型凝集素受体-12（COLEC12）、基质金属蛋白酶-12（MMP12）和粘蛋白-12（MUC12）基因。单因素和多因素Cox回归分析及绘制的ROC曲线结果显示,由这三个IIRGs构建的免疫风险特征集是一个显著影响HCC患者生存预后的独立危险因素,具有预后评估的价值。并且,上述三种IIRGs的表达均在GEO数据库和人类蛋白图谱数据库等外部验证中得到确认。值得注意的是,通过相关性分析发现,COLEC12和MMP12的表达与免疫检查点分子（PD-L1和CTLA-4）或免疫抑制细胞因子（IL-10和IL-23）的表达显著相关。但是,根据TIDE算法预测,HCC患者中这三种IIRGs表达的增加却与相对较差的免疫检查点阻断剂治疗（ICB）疗效显著相关。说明这个基因集不仅依赖于影响免疫检查点的表达,同时还可能存在其他的通路或机制来导致肝癌的免疫耐受,这需要我们通过更多的进一步研究去发现。通过这部分研究,我们对HCC患者构建并验证了一种新的先天免疫相关的Cox比例风险回归模型用于预测HCC患者的预后。该模型中的基因集可能存在多种机制参与HCC细胞的免疫耐受,是HCC患者潜在的免疫治疗靶点。2.第二部分研究结果:首先,IHC结果显示人肝癌组织中的COLEC12的表达明显高于癌旁组织,q PCR和WB结果显示肝癌细胞株LM03、Hep3B和Huh7中COLEC12的表达明显高于L02细胞（P＜0.05）,其中Huh7和Hep3B细胞中表达较高（p＜0.01）。用si RNA转染干预肝癌细胞株Hep3B和Huh7后,MTT法和Transwell法检测显示与对照组si-control相比,si-COLEC12组中肝癌细胞增殖和迁移/侵袭能力无明显变化。但是在随后建立的异种移植模型中,观察到干预COLEC12后对瘤体生长有抑制作用,IHC提示Lenti-sh-COLEC12组肿瘤组织中CD31、Ki67+细胞数量明显少于载体对照组。TUNEL的表达无显著性差异。IF结果显示,Lenti-sh-COLEC12组肿瘤组织中CD86+、CD206+细胞数量明显少于对照组,而NCR1的表达两组无显著性差异。COLEC12的表达在包括肿瘤细胞在内的大多数细胞的细胞膜和细胞质,CD86和CD206则表达巨噬细胞的细胞膜上,而NCR1表达于NK细胞的核膜上。si-COLEC12组的Hep3B、Huh7细胞与巨噬细胞M0共培养后发现其增殖、迁移/侵袭能力与对照组相比有所下降,p-AKt、p-STAT3,vimentin在si-COLEC12组中的表达显著低于si-control组,而E-cadherin在si-COLEC12组中的表达则显著高于si-control组,但Akt、β-catenin、STAT3在两组中的表达无显著差异。流式细胞术提示与对照组比较,与si-COLEC12组肝癌细胞共培养的巨噬细胞M0向M1和M2表型极化均显著下降,M2/M1率也显著下调。而与肝癌细胞共培养的巨噬细胞上清液中,转染siCOLEC12组的IL-10、TGF-β的表达量显著低于si-control组（P＜0.01）,而IL-23、TNF-α、IL-6 and IL-13两组之间无显著差别。本部分研究结果提示肝癌细胞COLEC12高表达促进微环境中巨噬细胞M0向M2极化增多,而极化后的M2则可能反过来促进肝癌细胞的生长。3.经过上部分的研究,我们发现COLEC12受体的高表达可诱导免疫耐受。本部分我们就围绕着肝癌细胞是如何通过上调COLEC12的表达来实现免疫耐受的机制进行研究。首先我们用免疫浸润研究工具Cibersorts和Timer分析比较了TCGA数据库中COLEC12和Toll样受体（TLR4）的免疫浸润特点,发现COLEC12与M0、M1、M2、NK和Tregs浸润显著相关（p＜0.01）,而TLR4则与M1、M2、NK cell、Neutrophil以及CD8+T cell的浸润明显相关（P＜0.01）。用spearman相关分析COLEC12和TLR4两个基因之间的表达相关情况发现在包含了TCGA-LIHC-Tumor,TCGA-LIHC-Normal和GTEx-Liver这三个分组的所有样本（Total组）中,这两个受体基因的表达成正向直线相关关系（R=0.2）,而分别在每个组中呈现出更加稳定的直线相关关系（R分别是0.28,0.43,0.63）。COLEC12和TLR4两个基因分别和巨噬细胞M1、M2的表型标记物CD86、CD206的表达相关情况显示:TLR4和CD86在TCGA-LIHC-Tumor,TCGALIHC-Normal、GTEx-Liver组和Total组的相关系数R分别是0.57,0.81,0.73,0.49;TLR4和CD206的对应组相关系数R分别是0.56,0.78,0.58,0.6;COLEC12和CD86的对应组相关系数R分别是0.53,0.44,0.68,0.59;COLEC12和CD206的对应组相关系数R分别是0.27,0.28,0.51,0.13;)。用DIANA tools预测COLEC12和TLR4共同作用的micro RNAs有十几个,选出碱基配对数最高的mi R-520b进行研究,通过双荧光素酶报告基因实验分析确定了COLEC12、TLR4与mi R-520b之间的相互作用。用敲降和复位实验进一步验证了COLEC12和TLR4的内源性竞争关系,即两者之间的表达成正相关,与上述生信分析结果一致。但是接下来IHC检测结果显示在所有的收集的人肝癌标本中（n=15）癌和癌旁组织中TLR4基因的表达均是强阳性,和上部分实验中COLEC12的IHC结果（COLEC12在癌组织中阳性表达,在癌旁组织中阴性或弱阳性表达）进行对比发现COLEC12在肝癌和癌旁组织之间表达是不同步的。再比较TCGA、GTEx数据库中肝癌、癌旁组织和正常肝脏组织中COLEC12和TLR4表达情况发现它们在癌和癌旁中表达的趋势是不一致的,详细来说就是COLEC12在癌组织中高表达,在癌旁组织中低表达,Log-FC（Fold Change）值＞0,但TLR4在癌组织中高表达,却在癌旁组织中表达更高Log-FC（Fold Change）值＜0。大数据中的统计结果和我院人肝癌标本的IHC结果是相吻合的。但是这两个结果与本章前两个研究得出的COLEC12和TLR4是成正比的内源性竞争关系这个结论似乎是相矛盾的。另外,我们通过分析比较这两个基因分别在以上组织中细胞亚群巨噬细胞M1和M2的贡献比例（即免疫活性和免疫抑制性）来看,这两个基因在各组中对M2的贡献比例都是高于M1的（M2/M1＞1）,并且COLEC12相对TLR4在各组中M2/M1比值均较高,说明COLEC12具有更强的免疫抑制性,也可以说组织修复性更强;再则,在Liver、TCGA-Normal和TCGA-Tumor组中两个基因的M2/M1比值都是逐渐降低的,说明伴随着炎症的待续存在,机体的组织修复能力衰退更明显。结论:1.本研究通过比较完整的生信分析和多角度的验证首次发现并提出COLEC12可能存在诱导不依赖免疫检查点的肝癌免疫耐受的机制。2.本研究首次通过体内体外实验证实了COLEC12高表达的肝癌细胞可通过与巨噬细胞互相作用,使得巨噬细胞M0向M2极化增多,M2释放的抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β通过AKT、STAT3和EMT等信号通路促进肝癌细胞的增殖、转移和血管生成。3.本研究首次结合大数据和基础实验揭示了COLEC12和TLR4的不完全对称的内源性竞争关系,即在慢性炎症过程中TLR4待续升高使得相应特异性mi RNAs的耗竭诱导了COLEC12的升高,导致了肝癌的免疫耐受。并在此基础上推理出肝脏不同免疫状态的模型。为肝癌的免疫治疗提供了新的靶点和方向。