结合土壤微生物组和菌核诱捕策略筛选水稻纹枯病生防因子

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhanbusha
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随着世界人口数的不断增加,人们对于水稻产量的需求也不断提高。而耕地面积的减少以及水稻病害的猖獗,威胁着水稻的生产安全。在这些病害中,由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病(Rice sheath blight)是水稻上的第二大病害,严重影响水稻的产量和质量。现如今,对于这种病害,最常用的控制方法是喷施化学农药。但由于化学防治所带来的生态环境及人类健康等问题,迫切的寻求一种绿色安全、经济高效的防治方法。而利用各种生防因子进行水稻纹枯病的生物防治是一种极佳的选择。在本研究中,自处于休耕期和种植期水稻田的田土中检测和分离了潜在的用于水稻纹枯病防控的生防因子。采集的土壤样品分为两部分,一部分利用土壤微生物组技术检测土壤中真菌群落的组成,同时探究潜在生防菌及病原菌的种类及丰度;另一部分,采用立枯丝核菌菌核诱捕生防菌候选菌株,并研究它们生物学特性及生物防治特性。高通量测序的结果显示,子囊菌门(Ascomycota)在所有土壤类型中都处于绝对的主导地位。与休耕期土壤相比,水稻田土壤中潜在的生防菌如篮状菌属(Talaromyces)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)及潜在的病原菌如丝核菌属(Rhizoctonia)的相对丰度高,而木霉菌相对含量低。预示蓝状菌适应水稻田土壤能力强,在水稻田土壤中生长和存活好。通过诱捕、分离培养,获得和鉴定了了17株潜在的生防菌,其中10株来自于水稻田土壤,7株来自于休耕期土壤。通过菌核寄生实验,发现这17株生防菌均可以有效地寄生立枯丝核菌的菌核,降低菌核的萌发率,对立枯丝核菌均有良好的抑制作用。研究发现最有效的候选菌株是木霉属和篮状菌属真菌,其中篮状菌属真菌大多从水稻田土壤中分离获得。接下来对获得的Talaromyces属菌株的生防潜能进行了研究。进一步探究了5株篮状菌属真菌分离株(TF-04、TF-03、TF-02、TF-01和TA-02)在不同培养基(PDA、PDB、MEA、CYA)、p H值(p H=3、4、5、6、7和8)、渗透势(0 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、和5 g/L的氯化钾溶液)以及温度(20、24和28℃)下的生长情况。发现在28℃下,PDA培养基的p H值为4-5,渗透势为0-0.3g/L KCl的条件下,各分离株的长势最好。这些生物学特性表明,蓝状菌可以适应在水稻田土壤中生长。显微观察表明,所有的篮状菌属真菌分离株都产生椭圆形的光滑的分生孢子和尖刺状的子囊孢子。TF-04、TF-01和TF-02的分生孢子梗为一次轮生,TA-02的分生孢子梗为一次轮生或二次轮生,TF-03为一次轮生且具有末端分支的分生孢子梗。通过系统分析菌株的ITS及β-tubulin,Calmadolin和RPB等基因的DNA序列,进一步将TF-01、TF-02、TF-03和TF-04鉴定为黄蓝状菌(Ta.flavus),而TA-02鉴定为亚西岛篮状菌(Ta.assiutensis)。采用对峙实验,评价了生防菌菌株对立枯丝核菌的抑制效果。发现TF-04可以有效地破坏立枯丝核菌的菌丝,不过TA-02的效果较差。通过显微观察,发现TF-04、TF-03、TF-02和TF-01的菌丝可以缠绕立枯丝核菌菌丝。所有分离株都具有产生抗真菌物质的能力,其菌丝体培养滤液、菌丝体挥发物产物和培养滤液粗提液均可以显著抑制立枯丝核菌的生长。在不同温度(20-32℃)、不同水势(1-11MPa)和不同环境(灭菌沙子、灭菌土壤、未灭菌土壤)下,评估了各分离株的分生孢子液喷施处理对立枯丝核菌的菌核的影响。在灭菌沙子中,接种TF-04、TF-03、TF-01、TF-02和TA-02孢子液后,菌核的致腐率为85%、83%、81.66%、80%和38.33%。在土壤中,也得到了相类似的结果,TF-04孢子液喷施处理的菌核致腐率最高,TA-02孢子液喷施处理的菌核致腐率最低。因此,分离株TF-04是最佳的生防菌菌株。为了能在温室和田间环境下评估各候选离株在水稻上抑病促生长效果,对利用分离株孢子液处理水稻种子和水稻植株的条件进行了优化。发现在温室环境下,孢子浓度为107个/ml时处理6小时,可以显著的提高幼苗株高、根长、幼苗鲜/干重和根鲜/干重。随后,在温室和室外环境下,评估了TF-04、TF-03、TF-02和TF-01的抗病增产效果。在温室条件下,各分离株孢子液种子处理,可以显著降低了水稻纹枯病的病情指数。与对照组的水稻纹枯病的病情指数(72.75)相比,TF-04分离株处理组的水稻纹枯病的病情指数(37.70)显著降低。在温室条件下,各分离株孢子液蘸根处理植株,也可以显著降低了水稻纹枯病的病情指数。与对照组的水稻纹枯病的病情指数(79.36)相比,TF-04分离株处理组的水稻纹枯病的病情指数(48.40)依然显著降低。此外,经TF-04孢子液处理后,水稻植株的株高、生物量、分蘖数、产量和千粒重均比其他处理组和对照组高。与温室的结果相类似,在室外环境下,各分离株孢子液种子处理及植株处理,均可以控制水稻纹枯病的发生。在供试的分离株中,与对照组相比,TF-04处理植株的株高、鲜重、干重、分蘖数、单穴有效分蘖数、穗长、千粒重和产量均有较大幅度的提高。在不接种纹枯病菌的情况,利用TF-04菌株种子处理和蘸根处理,水稻产量分别为205.2g/盆和228.5g/盆,对照产量分别为135.2g/盆和160g/盆,分别增产51.8%和42.8%;在接种纹枯病菌的情况下,种子处理和蘸根处理后,产量分别为145.4g/盆和135.2g/盆,对照产量分别为81.9g/盆和113g/盆,分别增产77.5%和19.6%。在室外环境下,还使用了不同浓度(107、106和105个/ml)的TF-04孢子液处理水稻种子。发现与对照组相比,在所有浓度下,TF-04均可以促进水稻生长,但最佳浓度为107个/ml。通过扫描电镜和使用携带绿色荧光蛋白(GFP)的TF-04菌株观察发现其可以在水稻根部定植。研究还发现TF-04处理可以激活水稻的防卫反应相关基因的表达及增强防卫相关酶类的活性,并提高水稻叶绿素总含量。表明黄蓝状菌可能具有复杂的生物防治机制。综上所述,本研究将高通量测序技术与传统的分离鉴定技术相结合,成功的从稻田土壤中分离鉴定出了显著抑制水稻纹枯病、提高水稻产量提高的篮状菌属真菌TF-04菌株。此研究,为水稻生产及其纹枯病的绿色防治提供给了新的思路和有益微生物,具有重要的理论和实践意义。
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