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热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，是生物细胞应激反应的诱导产物。HSP在机体的免疫应答过程中发挥着重要作用，通过参与抗原加工递呈、T细胞活化等过程，诱导机体产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），与机体的抗肿瘤免疫、抗感染免疫、以及自身免疫性疾病发生发展的病理机制密切相关。HSP由于其独特的佐剂（adjuvant）效应一直是近年来免疫学研究的热点，被认为在抗肿瘤和抗感染免疫中有极大的应用前景。 研究证实，从肿瘤组织中分离的HSP在动物体内能诱导出明显的肿瘤特异性CTL，对随后接种的肿瘤细胞具有抵抗作用。HSP在抗原递呈过程中的佐剂样作用及小分子肽的免疫原性是HSP介导的特异性免疫反应所不可缺少的两个重要部分。采用HSP-抗原肽复合物作为疫苗诱导抗肿瘤、抗感染免疫已经进入临床试验阶段并显示了良好的应用前景。但作为个体化的治疗模式，该方案的大规模应用具有很大的局限性。最近研究显示，基因工程表达及纯化的HSP分子与抗原肽的融合蛋白同样可以在动物体内显著地诱导出肿瘤特异性CTL和保护性的抗肿瘤免疫反应，有望克服以往从肿瘤细胞中制备的HSP-肿瘤抗原肽作为疫苗个体化应用的局限性，成为一种新型疫苗和新的治疗模式。 Hsp70L1（Hsp70-like protein 1，Hsp70L1）是本室通过人外周血单核细胞来源的树突状细胞（Dendritic cells，DC）cDNA文库大规模随机测序发现的一个新分子，生物信息学分析表明该分子具有典型HSP70家族的特征，和HSP70家族成员具有较高的同源性。前期的研究结果提示Hsp70L1具有与HSP70类似的佐剂样效应，Hsp70L1与MHCⅠ限制性的鸡卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）抗原八肽(OVA257-264，氨基酸序列为SIINFEKL)的交联复合物免疫小鼠可以在小鼠体内诱导产生OVA抗原肽特异性的抗肿瘤免疫。本课题的研究目的是在此基础上，构建OVA抗原与Hsp70L1的融合蛋白表达纯化体系，进一步通过体内外试验，研究融合蛋白中Hsp70L1的佐剂效应特点及其机制，为以后Hsp70L1与不同抗原的融合蛋白可能的临床应用打下基础。研究分三个部分进行。第二军医大学硕士学位论文第一部分ova一Hsp70LI融合蛋白和相关对照蛋白的原核表达与纯化 以含全长ovA序列的载体PcDNA3一ovA为模板，用PcR的方法扩增编码OVA161.276（OVA的161至276位氨基酸残基组成的蛋白片段，包含OvA257264序列，本文中简称ova）序列的编码片段，构建pET24a一ova载体;以本室构建的包含HsP7OLI cDNA的全部编码区序列的pQE30一Hsp70LI质粒为模板，用PCR扩增出编码HsP70LI序列的编码片段，酶切后连接入pET24a一ova，构建pET24a一ova一Hsp70LI质粒载体，又通过pCR和酶切的方法，把ova-Hsp7oLI的编码序列连接入pQE30空载体，构建出可表达ova一Hsp70LI融合蛋白的表达质粒pQE30一ova-Hsp7oLI。以本室构建的penNA3一Hsp7o为模板，PeR扩增出Hsp7o编码序列，经酶切、连接构建pET24a一Hsp7o和pET24a一 ova一Hsp7o表达载体，可表达。va-Hsp7O融合蛋白和Hsp70重组蛋白。以上构建的载体均经PCR、酶切和测序鉴定。可表达Hsp7oLI重组蛋白的质粒载体pQE30一Hsp70LI由本室构建。 pET24a一ova和pET24a-ova一Hsp70质粒分别转化大肠杆菌BLZI[DE3]，在LB培养基中用IPTG诱导表达，经SDS一PAGE分别观察到大约14kD（ova理论分子量为13.IkD）和50切（ ova一Hsp70理论分子量为13.IkD+6s.4kD=sl.skD）的诱导表达条带，蛋白均以包涵体形式表达。pET24a一Hsp70质粒转化BL21[D E3]感受态细菌后同样经IPTG诱导，sDs一队GE电泳后发现表达68kD（HsP70理论分子量为68.4kD）的诱导蛋白于细菌裂解上清中。pQE30一ova一HsP70LI质粒转化大肠杆菌M15印REP4)。转化子在ZYT培养基中，用IPTG诱导表达，sDs一PAGE观察到约68kD（ova-Hsp7oLI理论分子量为ova 13.1扔+Hsp7oL 154.5扔=67.9kD）的诱导表达条带，蛋白以包涵体形式表达。表达的蛋白均用不同浓度IPTG经不同诱导时间确定最优化的诱导表达条件。为了尽量减少各种纯化蛋白中LPS的污染，在收菌后尽快超声裂解菌体，对包涵体用含有0.1%TritonX一100和ZM脉的洗涤液进行多次充分的洗涤。洗涤后的ova-Hsp7oLI、ova一Hsp7o、 ova和HsP70LI包涵体分别用SM脉溶解，变性蛋白优先结合到Ni+金属离子鳌合层析柱，洗去杂蛋白，柱上复性。复性洗脱的蛋白再用阴离子交换层析进一步纯化，最后透析至PBS中冻存待用。诱导表达Hsp70的细菌裂解上清经预处理后，依次用Ni+金属离子鳌合层析、离子交换层析进行纯化，纯化产物透析至PBS中冻存待用。 纯化的各蛋白经SDS一PAGE电泳染色鉴定，扫描分析纯度均大于95%;用赏第二军医大学硕士学位论文试剂检测LPS含量均小于1 EU/mg蛋白。第二部分ova一Hsp70LI融合蛋白对树突状细胞成熟及其抗原提呈功能的促进作用 DC是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节，已知的佐剂发挥佐剂效应，多与DC有关。前期研究发现，HsP70LI可诱导Dc分泌趋化因子和前炎性细胞因子、表达趋化因子?