昆虫黑色素合成及沉积与体色形成、免疫防御、表皮黑化及硬化等生理活动密切相关,不同种昆虫黑色素合成通路也不尽相同。昆虫黑化反应始于酪氨酸,酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）催化酪氨酸（Tyrosine）生成多巴（Dopa）,多巴经多巴脱羧酶（Dopa decarboxylase,DDC）的作用形成多巴胺（Dopamine）,再经由N-乙酰基转移酶（Arylalkylamine N-acetyltransferase,aa NAT）、天冬氨酸脱羧酶（Aspartate Decarboxylase,ADC）、NBAD水解酶（tan）、NBAD合成酶（Ebony）及yellow蛋白等作用完成体壁的黑化和硬化,其中,多巴和多巴胺的合成对黑色素的形成至关重要。柞蚕Antheraea pernyi属于鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,其在自然条件下营茧化蛹为黑色蛹（90%以上）,这一过程伴随着一系列复杂的生理生化反应及形态变化,柔软透明的表皮会在短时间内黑化和硬化,如在较高温度（28±1℃）下化蛹则为黄色蛹（95%以上）,有关柞蚕化蛹过程中黑化反应机理研究还未见报道,而这方面的研究对阐明柞蚕化蛹中体色变化机制具有重要意义。本研究以柞蚕化蛹期间体色黑化为切入点,克隆鉴定黑色素合成的关键基因,采用RNAi和酶抑制剂研究了ApTH和ApDDC的生理功能,为进一步挖掘鉴定柞蚕黑色素合成关键基因及阐明柞蚕黑色素合成的分子机制奠定基础,也为创建黄体色蛹遗传资源提供理论依据。主要研究结果如下:1.柞蚕酪氨酸羟化酶基因在黑色素合成过程中的功能克隆得到ApTH基因（Gen Bank登录号为MW677189）,全长为6 984 bp,含有7个外显子和6个内含子,ORF为1 686 bp,编码561个氨基酸,相对分子质量为63.5 k D,等电点为5.29,有一个Biopterin＿H结构域。系统进化分析结果证明,ApTH与其他鳞翅目昆虫聚在一起。ApTH主要在表皮、脂肪体和血淋巴中高表达,并且在化蛹期间的表皮组织中持续高表达。RT-q PCR检测表明ApTH在取样后的36 h（大约化蛹前1 d）表达量开始上升,与0 h相比,ApTH在48 h时增加了419倍,60 h达到峰值（比0 h时高5028倍）;ApTH在60 h后表达量开始减少,在76 h（化蛹0 h）时的表达量下降与化蛹前（48 h取样点）表达量相当,之后表达量下降到较低水平。RNA干扰ApTH后柞蚕蛹背部表皮颜色变浅,ApTH和ApDDC表达量显著下降,而ApPPO表达量显著提高;注射TH酶抑制剂（3-iodo-tyrosine,3-IT）后,高浓度的酶抑制剂促使柞蚕形成黄色蛹的同时也增加了蛹畸形率和死亡率,并且PPO酶活性显著提高。表明ApTH是柞蚕黑色素合成过程中的关键基因,而且ApTH和ApPPO可能存在代偿作用。2.柞蚕多巴脱羧酶基因在黑色素合成过程中的功能克隆得到ApDDC基因（Gen Bank登录号为MW677190）,全长为9 784 bp,ORF为1 476 bp,编码了491个氨基酸,相对分子质量为55.7 k D,等电点为5.74,具有一个Pyridoxal＿de C结构域。ApDDC氨基酸序列比对分析后发现与家蚕的一致性最高,为87.91%。系统进化分析结果显示,ApDDC与其他鳞翅目昆虫同源序列聚在一起。ApDDC主要在表皮、中肠、脂肪体和血淋巴中高表达,与24 h相比,表皮中的表达量在60 h时显著增加。RT-q PCR检测表明,ApDDC从36 h到60 h,表达量迅速增加并达到峰值（12.23倍）,持续到76 h（化蛹0 h）均处于较高水平。取样的85 h（化蛹9 h）后,ApDDC的表达量比76 h（化蛹0 h）降低了5.39倍。注射ds DDC后ApDDC和上游基因ApTH的表达量都显著降低,注射DDC酶抑制剂（L-α-Methyl-DOPA,L-α-DOPA）后柞蚕蛹体色发生了明显变化,高浓度的酶抑制剂促进黄蛹形成的同时也增加了柞蚕蛹的畸形率和死亡率。表明ApDDC基因是柞蚕黑色素合成过程中的重要基因。3.柞蚕黑色素合成通路相关基因的表达模式采用实时荧光定量PCR技术分析了ApLac2、ApPPO、ApADC、Apebony和Aptan在化蛹期间的表达模式,表明化蛹前2 d左右是柞蚕蛹形态变化和黑色素合成相关基因显著表达的关键阶段。结合果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、赤拟谷盗Tribolium castaneum等模式生物的黑色素合成通路,推导了柞蚕黑色素合成与多巴、多巴胺、去甲肾上腺素、章鱼胺合成的部分途径。