论文部分内容阅读
目的:观察新型长效GLP-1类似物Semaglutide能否有效改善阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）APP/PS1/tau转基因小鼠的认知功能损伤和脑内典型的AD病理特征;进一步从细胞和分子水平探讨Semaglutide发挥神经保护作用的抗炎机制,从而为抗糖尿病药物GLP-1类似物用于治疗AD提供可靠的基础理论支持。方法:1.在体动物实验将7月龄的3xTg-AD小鼠以及野生型小鼠随机分为四组:正常对照组（WT+PBS）、AD模型组（3xTg+PBS）、Semaglutide对照组（WT+Semaglutide）以及Semaglutide治疗组（3xTg+Semaglutide）。采用腹腔注射方式,每两天给予一次Semaglutide（25nmol/kg）或等量的PBS,持续给药30天。30天后,依次进行后续行为学的检测。首先进行旷场实验,用来排除小鼠运动能力、探索能力的障碍对实验结果的影响。第二天开始进行Y迷宫实验记录,将正确自发交替率作为小鼠工作记忆能力的评估指标。接下来进行Morris水迷宫实验,共6天时长,其中前五天进行定位航行实验,逐日记录各组小鼠寻找潜在平台的逃避潜伏期及游泳轨迹图以评估长时程空间学习的能力是否改善;第六天进行空间探索实验,观察各组小鼠在目标象限游泳的时间百分比和穿梭平台次数用于评估小鼠的记忆能力;最后进行可视平台实验,检测各组小鼠的游泳运动能力和视力,排除其对水迷宫实验的影响。行为学实验结束后,一部分小鼠的脑组织用作免疫组化,检测其脑内海马Aβ的分布及含量,评估Semaglutide对AD病理特征的影响。另一部分取海马及皮层组织,利用qPCR、ELISA技术检测GLP-1R、CD86、CD206、IL-1β、TNF-α等相关炎性因子的表达,利用Western blot技术分析M1、M2型胶质细胞标记物相关蛋白的表达水平,检测海马及皮层组织中GLP-1受体表达情况,以阐述Semaglutide发挥神经保护作用的可能机制。2.离体培养细胞实验将培养的BV2小胶质细胞分为:正常对照组（BV2+vehicle）、Aβ模型组（BV2+Aβ）以及给药组（BV2+Semaglutide+Aβ）。（1）采用细胞形态观察、细胞活力测定、细胞凋亡检测,验证Aβ1-42激活BV2细胞模型的成立;测定Semaglutide对Aβ1-42刺激的BV2细胞活力、凋亡现象,促炎/抗炎因子释放的影响,评价Semaglutide抗炎的神经保护作用。（2）采用qPCR、ELISA、Western blot技术,研究Semaglutide对Aβ1-42所致BV2细胞炎症相关因子的变化情况,并对关键蛋白进行验证,同时检测Semaglutide对BV2细胞GLP-1受体表达的影响。结果:1.动物实验（1）旷场实验中,四组小鼠在5min内的运动总距离及在中央区域停留的时间百分比均没有明显差异（P>0.05）。（2）Y迷宫实验四组小鼠在8min内的进臂总次数没有统计学差异（P>0.05）;与WT+PBS组小鼠相比,3xTg+PBS组小鼠自发正确交替率降低（P<0.001）,经过Semaglutide治疗后的3xTg小鼠自发正确交替率明显提高（P<0.01）。（3）经典Morris水迷宫四组小鼠在定位航行实验中,逃避潜伏期随着训练天数的延长均有不同程度的下降;从第二天开始,3xTg+PBS组小鼠的逃避潜伏期与WT+PBS组相比开始出现明显差异（P<0.01）,而经过Semaglutide治疗后的3xTg小鼠比3xTg+PBS组小鼠明显缩短;从第三天起与3xTg对照组小鼠存在显著差异（P<0.01或P<0.001）;在接下来的空间探索实验中,3xTg+PBS组小鼠在目标象限停留的时间百分比明显比WT+PBS组减少（P<0.001）;给药后的3xTg小鼠在目标象限的游泳时间百分比与Semaglutide+3xTg组明显增多（P<0.001）。在可视平台实验中,各组小鼠到达可见平台所用时间并没有明显差异（P>0.05）。（4）qPCR、ELISA、Western blot实验与WT+PBS组相比,3xTg+PBS组小鼠海马、皮层组织中的CD86、IL-1β、TNF-α表达水平发生不同程度的升高（P<0.01）,CD206、IL-4、IL-10表达水平降低（P<0.01）。经Semaglutide治疗后,这些因子的表达水平均有不同程度改变（P<0.01）;在3xTg组小鼠脑内GLP-1R的表达下降（P<0.01）,给予Semaglutide后没有明显变化（P>0.05）。（5）免疫组化3xTg+PBS组小鼠海马内有大量Aβ斑块沉积,与WT+PBS组小鼠相比具有显著的统计学差异（P<0.001）;经Semaglutide处理后的3xTg小鼠较没有接受药物处理的3xTg小鼠Aβ明显减少（P<0.01）。2.细胞实验（1）CCK-8实验:Aβ对BV2小胶质细胞有明显的细胞毒性作用,而Semaglutide预孵可逆转Aβ1-42的毒性,缓解细胞凋亡现象,保护BV2小胶质的活性。（2）qPCR、ELISA、Western blot实验与BV2+vehicle相比,BV2+Aβ模型组中BV2细胞CD86、IL-1β、TNF-α水平发生不同程度的升高（P<0.01）,CD206、IL-4、IL-10表达水平降低（P<0.01）,经Semaglutide治疗后,这些因子表达水平均有不同程度改变（P<0.01）;且Aβ刺激后,GLP-1R表达水平下降,给予Semaglutide处理后受体表达水平没有明显改变（P>0.05）。结论:Semaglutide慢性处理可改善3xTg-AD小鼠短时程工作记忆和长时程空间学习记忆能力,减少了3xTg-AD小鼠海马内Aβ斑块的沉积。Semaglutide预处理还有效拮抗Aβ引起的细胞毒性,减轻细胞损伤。Semaglutide不改变其作用受体的表达发挥类似GLP-1的作用。Semaglutide可能通过诱导小胶质细胞M1型向M2型转化来发挥其抗炎作用,维持微环境稳态,从而起到对神经元的间接保护作用。因此,根据以上结果,我们推测:Semaglutide通过激活GLP-1受体,改善脑内微环境中炎性介质的释放,从而发挥神经保护作用。