目的和意义:心肌肥大是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立的危险因素,是高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等临床常见疾病的一种并发症。近年来已有大量研究表明单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)对心肌肥大具有抑制作用,血红素氧合酶-1(HO-1)即热休克蛋白32(HSP32),是血红素氧合酶(HO)的同工酶之一,HO-1在体外和体内实验中均被证实能抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥厚的进展,能调节AngⅡ所致的心血管重构过程,为研究HO-1在AMPK抑制心肌肥大中的作用,AMPK激活对心肌肥大的影响及机制,我们设计了本研究,观察AMPK激活对心肌肥大的影响,及其对eNOS、p38MAPK的作用以及NOS/NO、p38MAPK在HO-1激活中的作用,探讨AMPK对激活HO—1的作用及机制。从而阐明HO—1在AMPK抑制心肌肥大中的作用。　　 方法与结果:本研究在AngⅡ诱导的新生乳鼠心肌细胞肥大实验模型中观察了AMPK的激活剂5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside,AICAR)对心肌细胞HO-1的激活效果,并进一步探讨了p38、NO和核转录因子Nrf2在AMPK激活HO—1中的作用。并通过测定细胞面积及亮氨酸摄入率评价心肌肥大的影响。具体方法及结果如下:　　 1.细胞培养:新生大鼠原代心肌细胞培养　　 2.确定AMPK对HO—1激活　　 首先确定AICAR对AMPK的激活,以10.7 mM AngⅡ[1]刺激心肌细胞肥大,建立AngⅡ诱导的新牛乳鼠心肌细胞肥大实验模型,在此模型上以Western Blot观察AngⅡ、AICAR、Compound C对心肌细胞中AMPK蛋白表达的影响,证实AICAR对AMPK的激活作用及Compound C对AICAR激活作用的阻断。继而观察AMPK对HO-1激活的浓度梯度,从而确定AMPK激活HO-1的最佳浓度:10-7 mM AngⅡ刺激心肌细胞肥大,建立AngⅡ诱导的新牛乳鼠心肌细胞肥大实验模型,在此模型上以不同浓度(0.5,1.0,3.0mM)AICAR诱导AMPK的激活,24小时后以RT-PCR、Western Blot分别测定HO-1 mRNA及蛋白水平变化,确定对HO-1激活最明显的AICAR浓度作为后续的实验所用,然后观察AMPK对HO-1激活的时间曲线,用上述确定的AICAR浓度分时间点干预心肌细胞,干预细胞后4,6,8,12,24小时后以RT-PCR及Westem Blot观察HO—1的表达,确定HO-1表达最明显的时间点为后续的实验所用。用上述实验所得的AICAR的浓度及时间点干预心肌细胞,Western Blot测定HO-1的蛋白水平表达,分组:正常对照组(Control)、AngⅡ组、AngⅡ+AICAR组、AngⅡ+AICAR+Compound C组。　　 结果:AngⅡ与AICAR能激活HO-1,AICAR对HO-1的激活呈剂量和时间上的相关性:1.0mM浓度AICAR激活HO-1最明显；而AICAR激活HO-1的最明显的时间点为8小时。用1.0mM AICAR干预肥大的心肌细胞8小时后,观察HO-1的表达,结果显示与Control相比,AngⅡ组、AICAR组HO-1表达均增加,AICAR组表达最高,而AngⅡ+AICAR+Compound C组HO—1表达无增高,与正常对照组接近,表明AMPK对HO-1起激活作用,阻断AMPK的激活则能阻断AICAR对HO-1的激活。　　 3.探讨AMPK激活HO-1的机制.　　 1)eNOS及p38在AMPK激活HO-1中的作用。首先观察AMPK对p38磷酸化激活的时间梯度,在AngⅡ诱导的新生乳鼠心肌细胞肥大实验模型,1.0mM AICAR干预心肌细胞不同时间后(30,60min,2,4,8,16,24h)以Western Blot测定p38磷酸化形式的表达,确定其激活最明显的时间。然后在此时间点上观察eNOS及p38在AMPK激活HO-1中的作用,即通过阻断eNOS和p38观察eNOS及p38对HO—1的影响。分组Control,AngⅡ,AngⅡ+AICAR,AngⅡ+L-NAME(eNOS阻断剂),AngⅡ+SB203580(p38阻断剂),AngⅡ+AICAR+L-NAME,(根据文献选择SB203580、L-NAME浓度),以Westernblot测定HO-1的蛋白表达。　　 结果:AngⅡ及AICAR均能引起p38 MAPK磷酸化形式的表达增高,AICAR对磷酸化p38的激活呈时间上的相关性,表达高峰出现在4小时,激活持续至24小时。在AICAR处理后4小时观察阻断eNOS、p38对HO-1的影响,结果提示:阻断p38能明显减弱HO-1的表达,而阻断eNOS对HO-1的激活有减弱作用,但不明显。　　 2)Nrf2在AMPK激活HO—1中的作用在AngⅡ诱导的新牛乳鼠心肌细胞肥大实验模型中,于AICAR处理后8小时通过免疫荧光观察激活及阻断eNOS、p38对Nrf2核转位的影响,分组:AngⅡ,AngⅡ+AICAR,AngⅡ+AICAR+SB203580,AngⅡ+AICAR+L-NAME。　　 结果:AngⅡ、AngⅡ+AICAR组Nrf2在核内表达增多,而正常对照组及AngⅡ+AICAR+SB203580,在核内表达较少。AngⅡ+AICAR+L—NAME组Nrf2核内表达与AngⅡ、AngⅡ+AICAR组相近。　　 4.评价AMPK激活对心肌肥大的影响　　 通过在光学显微镜下观察心肌细胞形态,并用计算机辅助软件对细胞表面积进行测量；以及采用[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成以评价心肌肥大。检测AngⅡ,AICAR,L-AME,ZnPPIX(HO—1阻断剂)和SB203580对心肌细胞肥大的影响。分组:Control,AngⅡ,AngⅡ+AICAR,AngⅡ+AICAR+L—NAME,AngⅡ+AICAR+ZnPPIX,AngⅡ+AICAR+SB203580。　　 结果:AngⅡ能引起心肌细胞面积增大,蛋白质合成增加,而AICAR能阻断AngⅡ引起的心肌肥大效应；阻断p38和HO-1的激活则能减弱AICAR的抑制心肌肥大作用,表现为加入阻断剂后心肌细胞表面积增大,蛋白合成率增加。而阻断eNOS则对心肌面积,蛋白质合成率无影响。　　 结论:1、AMPK具有抑制心肌肥大的作用,AMPK在HO-1的激活中起重要作用,HO-1作为AMPK的下游因子在AMPK抗心肌肥大的机制中起重要作用。2、AMPK对HO-1的激活主要通过磷酸化P38 MAPK,引起转录因子NRF2进入核内,从而触发HO-1的激活。3、而eNOS/NO途径对HO-1的激活在本研究中尚不能证实,还需要进一步的实验证明。