研究背景与目的:骨缺损的再生修复,是口腔颌面外科、口腔种植、牙周等专业面临的重要挑战之一。目前有异体骨移植、自体骨移植、牵张成骨等修复方法用于临床骨修复重建,均存在一定的局限性。因此,研发新的骨缺损修复方法是临床亟待解决的问题。研究发现,免疫系统特别是巨噬细胞在骨组织再生修复中发挥关键作用,并且巨噬细胞与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）相互作用影响骨组织再生修复。骨组织的修复始于炎症,炎症类型的转换决定骨组织修复的结局。巨噬细胞根据微环境可极化为不同的表型。在炎症的急性期,巨噬细胞首先表现出经典的M1激活表型,诱导炎症反应并释放促炎介质;在炎症后期,巨噬细胞向M2型极化,释放抗炎介质、细胞因子和趋化因子,从而减轻炎症反应,避免严重的免疫病理反应,加速伤口愈合过程和组织修复。M1和M2型巨噬细胞之间的平衡对于炎症及骨修复至关重要。在骨修复早期,M1巨噬细胞促进BMSCs增殖和迁移;中后期,M2巨噬细胞增加BMSCs基质矿化。因此,通过免疫调节M1/M2的极化,使其能在骨再生过程中的适当时间发挥适宜的作用就显得尤为重要。研究表明,通过旁分泌释放的外泌体（exosomes,Exos）在巨噬细胞调控BMSCs成骨分化过程中发挥了重要作用。巨噬细胞分泌的外泌体是组织损伤微环境中细胞间通讯的重要介质,通过在细胞间转运蛋白、胆固醇及核酸（包括miRNA）等实现供体细胞对受体细胞的调控作用。miRNA是外泌体中重要的内容物,巨噬细胞外泌体作为载体,携带miRNA在巨噬细胞与BMSCs之间进行信息传递,将成骨分化的调控信号从巨噬细胞传递至BMSCs。外泌体所转移的miRNA在进入受体细胞后通过对靶基因的调控进而影响受体细胞的生物学功能。鉴于此,本研究以临床问题为导向,立足于骨缺损再生修复研究,首先探究来源于不同极化状态的M1与M2巨噬细胞外泌体对小鼠BMSCs与成骨前体细胞系MC3T3-E1的成骨分化的影响;其次,分析验证M1与M2巨噬细胞外泌体中的差异表达miRNA,并通过体内外实验研究巨噬细胞外泌体通过该miRNA对成骨分化的调控作用;最后,研究巨噬细胞外泌体中该miRNA通过靶基因调控受体细胞的作用机制。以明确巨噬细胞外泌体在骨重建中的调控机制,从炎症调控角度更加全面地揭示骨组织修复再生的机理。方法:一、不同极化状态的巨噬细胞及其外泌体对成骨分化的作用1、采用 100 ng/ml LPS+20 ng/ml IFN-γ、20 ng/ml IL-4 试剂分别诱导 RAW264.7 巨噬细胞为M1和M2型;并通过流式细胞术、qRT-PCR、免疫细胞化学法等方法检测M1型（CD86、iNOS）及M2型（CD206、Arg-1）巨噬细胞的特异性标志物的表达。2、采用全骨髓贴壁法分离、培养小鼠原代BMSCs,采用流式细胞术检测BMSCs的特异性阳性标志物CD106、CD90和阴性标志物CD45、CD34的表达。并通过茜素红染色、油红O染色及阿利辛蓝染色,检测BMSCs的多向分化潜能。3、采用超速离心法分离纯化M0型、M1型、M2型巨噬细胞的外泌体,并通过电镜观察超微结构形态,纳米颗粒粒径分析（NTA）检测粒径和浓度,纳米流式检测CD81、CD63蛋白表达的水平。4、分别将巨噬细胞（M0型、M1型、M2型）培养上清及其外泌体与BMSCs和MC3T3-E1共培养。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和茜素红染色、qRT-PCR检测成骨相关基因,研究不同表型巨噬细胞及其外泌体对成骨分化的影响。Transwell实验研究巨噬细胞培养上清及其外泌体对BMSCs迁移的影响。二、miR-21a-5p在巨噬细胞外泌体促成骨中的作用研究1、利用miRNA基因芯片技术分析M1、M2型巨噬细胞外泌体中miRNA表达谱的变化,筛选出差异表达的miRNA并利用qRT-PCR验证。2、采用分子生物学技术构建敲减及过表达miRNA-21a-5p的M1型巨噬细胞模型,分离纯化 sh-miRNA-21a-5p-M1-Exos、oe-miRNA-21a-5p-M1-Exos。将外泌体分别与BMSCs和MC3T3-E1共培养,通过ALP与茜素红染色、qRT-PCR检测成骨相关基因,研究外泌体中的miRNA-21a-5p在调控成骨分化中发挥的作用。3、应用PKH67绿色荧光标记试剂盒标记M1、M2型巨噬细胞外泌体（PKH67-M1-Exos、PKH67-M2-Exos）,将其与 BMSCs 共培养后,观察 BMSCs 对外泌体的摄取情况。4、构建过表达miR-21a-5p的MC3T3-E1细胞模型。通过ALP与茜素红染色、qRT-PCR检测成骨相关基因,研究miRNA-21a-5p调控MC3T3-E1成骨分化情况。三、巨噬细胞外泌体对大鼠颅骨缺损模型修复的影响使用环钻构建直径5 mm的大鼠颅骨临界骨缺损模型,并植入负载外泌体的水凝胶。左侧均为空白对照组,右侧分别为水凝胶组、水凝胶+M1-Exos组、水凝胶+M1-Exos（miR-21a-5p）组、水凝胶+M2-Exos 组。于术后2、4、8 w取材,通过影像学分析、H＆E染色、Masson染色观察外泌体/水凝胶复合物对缺损区骨修复的情况,免疫组织化学染色观察骨缺损区OCN蛋白的表达变化。四、miR-21a-5p通过调控靶基因促MC3T3-E1成骨分化的机制1、通过targetscan软件预测miR-21a-5p 靶基因,结合文献筛选出GATA结合蛋白2（GATA2）作为候选靶基因。在MC3T3-E1细胞中过表达miR-21a-5p,通过qRT-PCR和 Western blot 检测 oe-miR-21a-5p 对 MC3T3-E1 中 GATA2 的 mRNA 和蛋白表达的影响。2、构建过表达GATA2慢病毒载体,将oe-miR-21a-5p和oe-GATA2单独或共感染MC3T3-E1细胞。通过ALP、茜素红染色、qRT-PCR检测成骨相关基因,研究miR-21a-5p通过调控靶基因GATA2对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用。3、通过基因克隆技术分别构建野生型及突变型GATA2 3’-UTR荧光素酶报告基因（pMIR-GATA2-wt,pMIR-GATA2-mut）,分别转染 MC3T3-E1 细胞以及oe-miR-21a-5p-MC3T3-E1细胞。应用荧光素酶活性实验,检测miR-21a-5p对靶基因GATA2的调控作用及促成骨机制。结果:一、M1型巨噬细胞外泌体在早期（1w）显著促进BMSCs的迁移及成骨分化1、成功诱导RAW264.7为M1及M2型巨噬细胞,证实M1及M2型巨噬细胞可分别表达巨噬细胞特异性标志物CD86、iNOS及CD206、Arg-1。同时,成功分离培养了小鼠BMSCs。流式细胞术证实分离培养的细胞为BMSCs,表现为高表达干细胞标志分子CD90和CD106,而不表达造血系标记分子CD34及白细胞标记分子CD45。所得细胞具有成骨、成脂及成软骨的多向分化能力。2、采用超速离心法分离纯化M0型、M1型、M2型巨噬细胞的外泌体,透射电镜显示外泌体超微结构为透明球状,具有清晰膜的茶托样结构。粒径分析结果显示97%外泌体为直径30-150 nm的纳米粒子。纳米流式显示外泌体的特异性标记CD81、CD63蛋白均为阳性。3、通过ALP染色、茜素红染色、qRT-PCR实验证实,M0、M1和M2巨噬细胞外泌体对BMSCs和MC3T3-E1成骨分化均有促进作用,M1-Exos促进成骨更显著。M1-Exos组中BMSCs细胞的ALP染色加深,矿化结节增多,BMSCs和MC3T3-E1细胞成骨相关基因Runx2、BMP-2、OPN的mRNA表达水平最高。Transwell实验证实M1巨噬细胞外泌体可以显著促进BMSCs的迁移。二、M1巨噬细胞外泌体通过miR-21a-5p促进成骨分化1、利用miRNA生物芯片分析M1和M2外泌体差异表达的miRNA,并通过qRT-PCR验证后,发现miR-21a-5p在M1外泌体中差异表达最为显著。2、sh-miRNA-21a-5p-M1-Exos 组中 BMSCs 的 ALP 染色变浅,矿化结节减少,BMSCs和MC3T3-E1 的成骨相关基因Runx2、OPN、OCN的表达水平均降低。oe-miRNA-21a-5p-M1-Exos组中BMSCs的ALP染色加深,矿化结节增多,BMSCs和MC3T3-E1的成骨相关基因Runx2、OPN、ALP和BMP-2的表达水平均升高。3、将PKH67标记的M1、M2外泌体添加到BMSCs培养基中6h后,荧光显微镜成像显示BMSCs中存在PKH67标记的外泌体。4、oe-miR-21a-5p组中MC3T3-E1的ALP染色更深,矿化结节更多,qRT-PCR结果显示oe-miR-21a-5p可促进MC3T3-E1高表达OCN、ALP、COL-1,其中ALP表达水平升高最显著。三、巨噬细胞外泌体对大鼠颅骨缺损模型修复的影响大鼠颅骨缺损的体内实验中,M2-Exos组骨缺损愈合最快;M1-Exos和M1-Exos（miR-21a-5p）组骨缺损区愈合较好,M1-Exos（miR-21a-5p）组成骨优于M1-Exos组;水凝胶组骨缺损区有少量新骨形成,新生骨不连续;空白对照组未形成明显的骨性愈合。影像学检查、H＆E染色、Masson染色和免疫组化染色结果均显示,过表达miR-21a-5p的M1巨噬细胞外泌体会促进骨缺损的修复,而M2外泌体在成骨的中后期起到最佳的成骨作用。四、miR-21a-5p通过抑制GATA2表达促进MC3T3-E1成骨分化1、通过qRT-PCR和Western blot验证,过表达miR-21a-5p的MC3T3-E1细胞中的GATA2水平明显降低,证实miR-21a-5p可以调控MC3T3-E1中的GATA2表达。2、GATA2的过表达可以抵消miR-21a-5p过表达对MC3T3-E1细胞成骨的影响。证实miR-21a-5p是通过抑制靶基因GATA2的表达,从而促进MC3T3-E1成骨分化。3、通过双荧光素酶报告基因实验发现,miR-21a-5p可以明显降低野生型pMIR-GATA2-wt荧光素酶的活性,而对于突变型pMIR-GATA2-mut荧光素酶的活性没有影响。证实miR-21a-5p可以与GATA2的3’-UTR区结合,抑制GATA2表达进而促进MC3T3-E1的成骨分化。结论:本研究通过体内外实验探讨不同极化巨噬细胞外泌体在不同时期对成骨分化的顺序调控能力。证实在早期（1 w）,M0-Exos、M1-Exos与M2-Exos均能促进BMSCs和MC3T3-E1成骨分化,M1-Exos可以募集BMSCs并且更有利于成骨;中后期（4-8 w）M2外泌体促进成骨明显。通过miRNA生物芯片分析发现miR-21a-5p在M1-Exos中含量最高且表达差异最为显著,且M1巨噬细胞释放的外泌体携带miR-21a-5p,经受体细胞摄取后,促进其成骨分化,并揭示了 miR-21a-5p通过与下游靶基因GATA2的3’-UTR区结合,抑制GATA2表达进而促进MC3T3-E1成骨分化的机制。