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禽流感是由禽流感病毒引起的一种可感染家禽及野生鸟类的传染病。2017年7月至2018年8月,中国、意大利、南非等亚、欧、非国家及地区暴发了H5亚型禽流感疫情,严重冲击家禽业。DNA疫苗是一种新型基因工程疫苗,有研究发现,禽流感病毒HA基因制成的禽流感DNA疫苗对禽类具有良好的保护效果。由于DNA疫苗具有免疫原性低等问题,急需开发新型免疫增强剂来增强DNA疫苗的保护效果。本研究根据鸡的密码子偏嗜性对H5亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/P45/2016（H5N6）的HA基因进行优化,并将优化后的HA基因命名为opti-HA。将opti-HA克隆到载体p CAGGS-K中得到重组质粒,并将该重组质粒命名为p CAGGSK-opti-HA,将测序正确的阳性质粒转染到293T细胞中表达。Western blot结果显示,重组质粒p CAGGSK-opti-HA能高效表达HA蛋白,且表达的目的蛋白大小约为64 k Da,这说明重组质粒p CAGGSK-opti-HA能在293T细胞中成功表达。为研究鸡STING、鸡IL-7、鸡IL-8、鸡IL-15、鸭STING、鸭IL-8的重组质粒作为免疫增强剂是否能增强DNA疫苗的免疫效果,根据鸡的密码子偏嗜性分别对鸡STING基因、鸡IL-7基因、鸡IL-8基因、鸡IL-15基因进行优化,并将优化后的基因分别命名为opti-CKSTING、opti-CHIL7、opti-CHIL8、opti-CHIL15;根据鸭的密码子偏嗜性分别对鸭STING基因、鸭IL-8基因进行优化,并将优化后的基因分别命名为opti-DKSTING、opti-DKIL8。将上述优化后的基因带上HIS或HA标签后分别克隆到载体p CAGGS-K后得到重组质粒,并将这些重组质粒分别命名为p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL7-HA、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA、p CAGGSK-opti-CHIL15-HA、p CAGGSK-opti-DKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-DKIL8-HA。将测序正确的阳性质粒转染到293T细胞中表达。Western blot结果显示,各重组质粒均能在293T细胞中表达出大小正确的目的蛋白。为评估重组质粒p CAGGSK-opti-HA制备的DNA疫苗的免疫效果,以及重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA作为免疫增强剂的效果,将60只2周龄的鸡平均分为4组,分别为PBS组、p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组,采用腿肌多点注射的免疫方式,在第一次免疫两周后进行第二次免疫。通过微量血凝抑制试验显示:PBS对照组的血清抗体水平都为0;p CAGGSK-opti-HA组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为0.42log2、4.21log2;p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为1.29log2、5.08log2;p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为1.41log2、4.50log2。因此,p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组的血清抗体水平在免疫期间均呈现上升趋势。在整个免疫监测期内,p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组与p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组的血清抗体水平都比p CAGGSK-opti-HA组略高因此,p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组均能诱导鸡体内产生良好的抗体,重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA均能提高DNA疫苗在动物体内产生的抗体水平。在第二次免疫2周后,用100μL 106EID50禽流感病毒p45（2.3.4.4分支）对全部实验鸡进行攻毒,PBS对照组的鸡在攻毒后3天内全部死亡,其余各实验组的鸡均存活且无明显的临床症状。p CAGGSK-opti-HA组有2只鸡出现排毒;p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组有1只鸡出现排毒;p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组有2只鸡出现排毒。因此,重组质粒p CAGGSK-opti-HA作为DNA疫苗对H5亚型禽流感病毒（2.3.4.4分支）的攻击能够提供良好的保护效果,且该DNA疫苗与重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS共同免疫时对鸡群的保护效果最好,但无论是单独使用DNA疫苗还是DNA疫苗与免疫增强剂一同免疫,均有一些鸡出现排毒。