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天冬氨酸蛋白酶一般被称为酸性蛋白酶,在酸性条件下可催化水解蛋白质,是目前重要的工业用酶之一,被广泛的应用于饲料添加剂、酿酒、食品、皮革及医药等行业。胃蛋白酶属于天冬氨酸家族,是研究蛋白质结构与功能关系的重要模型。生产实践中,由于现有商品化的酸性蛋白酶的稳定性差和产量低,其应用受到了极大的限制。本文利用基因工程开展胃蛋白酶的表达研究,为解决这些问题提供了新的研究方向。第一,根据Genebank上公布的猪胃蛋白酶原A基因序列,进行引物设计,通过RT-PCR克隆获得了湖北白猪胃蛋白酶原A基因cDNA全长,包括一个1158bp的读码框,编码385个氨基酸,其中N区包含15个氨基酸组成的信号肽,成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成。与J04601比较,结果表明核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%。序列已提交Genebank,登录号为EF108301。第二,在猪胃蛋白酶原A克隆和序列分析的基础上,构建了毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K-pA,电转化GS115,通过纤维蛋白-醋酸洋红消化试验和干酪素琼脂平板法筛选出两株高表达菌株。还研究了不同pH、不同诱导时间、不同启始浓度和甲醇诱导浓度等因素对表达量的影响。结果表明:在pH7、诱导72h、启始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶原表达量为56mg/L,比优化前提高了1.7倍。WB检测显示,重组蛋白具有正常的生物活性。第三,根据毕赤酵母密码子的偏嗜性,利用定点突变,成功地对分布在基因的C区和N区两端的可能影响表达量的稀有密码子进行了优化,希望能够进一步提高重组酵母表达量。