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研究背景和目的病毒性心肌炎是由病毒侵犯心脏所引起的,以心肌急性或慢性炎性病变为主要表现的疾病,约有50%的病毒性心肌炎由柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3,CVB3）所致。病毒性心肌炎在儿童及青壮年中发病率较高,可导致急性猝死及扩张型心肌病,其发病机制尚不明确,而目前临床还没有特效药物及其治疗方法,因此研究开发安全有效的抗CVB3药物用于临床是极其重要的。余甘子（Phyllanthus em blica L.）是中国的传统中药材,在养生、保健和治病方面具有重要的药用价值。余甘根苷B及其类似物是从余甘子根中提取的一系列倍半萜类化合物,其中余甘根苷B经结构鉴定已确认是一种新化合物,对其抗病毒活性尚未有研究报道。本研究分别构建病毒性心肌炎的体外细胞模型和动物体内模型,对余甘根苷B的抗CVB3活性进行研究,并观察余甘根苷B对CVB3感染后宿主细胞凋亡情况的影响,初步探讨余甘根苷B抗CVB3的作用及其机制,为将来应用于临床提供科学的理论依据。实验方法1.体外实验（1）药效学实验以CVB3感染培养的Hela细胞建立体外病毒性心肌炎模型,采用细胞病变（CPE）法及MTT法检测细胞存活率。并通过药物在加入病毒前、后及药物与病毒同时加入细胞三种作用方式,检测余甘根苷B及其类似物的抗CVB3活性。以CVB3感染原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞建立体外病毒性心肌炎模型。观察CPE以及测定心肌细胞释放天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）的水平,检测余甘根苷B对心肌细胞的保护作用。（2）机制研究选择余甘根苷B有效剂量进行实验,应用流式细胞仪通过Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡率;采用蛋白质组学的方法、Real-time PCR、Western-blot检测余甘根苷B对CVB3感染细胞凋亡的影响。2.动物体内实验（1）药效学实验通过给Balb/c小鼠腹腔注射CVB3的方法建立CVB3病毒性心肌炎动物模型,通过观察实验动物一般生存状况,测定血清中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平,心肌组织中病毒滴度,以及心肌组织形态学改变,检测余甘根苷B对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用。（2）机制研究选择余甘根苷B有效剂量进行实验,采用TUNEL原位末端标记法对心肌组织进行凋亡形态学观察与分析,免疫组织化学法检测心肌组织caspase-3和bcl-2蛋白表达情况,以确定余甘根苷B对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响。实验结果1.体外实验（1）药效学实验结果余甘根苷B及其类似物均具有显著的抗CVB3活性,IC50分别为50.30μg/ml、195.62μg/ml、67.65μg/ml及50.23μg/ml,TI分别为9.21、8.96、6.20和6.46。三种作用方式结果显示,余甘根苷B及其类似物均可以抑制CVB3增殖,并对CVB3具有直接杀灭作用,但是不具有抑制CVB3吸附的作用。采用CPE法观察到余甘根苷B可以减轻CVB3感染心肌细胞所致的细胞病变,并能降低心肌细胞释放AST和LDH的水平,对CVB3感染的心肌细胞具有明显的保护作用。（2）机制研究结果经流式细胞仪Annexin V/PI双重染色法检测结果显示余甘根苷B可显著降低CVB3感染细胞的凋亡率;蛋白质组学结果显示余甘根苷B可促进一些抑制凋亡的蛋白表达,抑制某些CVB3蛋白的表达;Real-time PCR、Western-blot结果显示余甘根苷B可以在基因及蛋白水平抑制CVB3感染细胞caspase-3的表达,促进bcl-2的表达。2.动物体内实验（1）药效学实验结果余甘根苷B对Balb/c小鼠病毒性心肌炎有明显的治疗作用,能显著改善患病小鼠的一般生存状况,降低血清中LDH和CK的水平,及心肌组织中病毒滴度,心肌组织病理切片及电镜观察也显示余甘根苷B能明显减轻炎性细胞的浸润和心肌细胞的坏死程度。（2）机制研究结果TUNEL原位末端标记法检测结果显示余甘根苷B能显著抑制CVB3感染所致的心肌细胞凋亡,免疫组织化学检测结果也显示余甘根苷B能抑制CVB3感染后心肌组织中caspase-3蛋白的表达,促进bcl-2蛋白的表达。三、结论本研究首次发现:1余甘根苷B及其类似物在体外细胞模型中均具有明显抗CVB3活性和保护细胞作用。2余甘根苷B对CVB3感染所致动物体内外模型均能明显减轻CVB3感染所致的细胞病变,及对CVB3感染的心肌细胞也具有较强的保护作用。3余甘根苷B抗CVB3的主要作用机制可能与抑制CVB3感染所致细胞的凋亡有关,在基因和蛋白水平抑制caspase-3的表达,促进bcl-2的表达。本研究为今后进一步深入探讨余甘根苷B抗CVB3的作用靶点,作为新型的抗病毒性心肌炎的治疗药物进行研究奠定良好的基础。