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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种系统性、炎症性自身免疫性疾病,其表现为持续性的慢性滑膜炎,形成大量血管翳,进一步导致关节软骨及骨破坏,甚至引发畸形病变以及严重的并发症。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是RA疾病发生过程中的主要效应细胞,呈肿瘤细胞样生长,并通过分泌高水平炎性细胞因子、趋化因子、基质蛋白降解酶等,调控血管翳的形成,在关节软骨和骨组织的破坏过程中发挥重要作用。RA病变中细胞迁移、细胞侵袭、细胞增殖与凋亡、浸润生长等多种病理改变均与细胞骨架的变化有关。纤维状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin),是维持细胞形态和功能的基本细胞骨架,多种刺激可以引起其形态学改变,引发血-关节囊液屏障等生理性屏障通透性的增加,从而损伤其功能。研究表明,F-actin可由滑膜细胞和内皮细胞表达,受Rho A、p38MAPK、核转录因子(nuclear factorκB,NF-κB)等信号通路调控。栀子苷(Geniposide,GE)是从茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis中提取纯化得到的环烯醚萜苷类化合物,具有抗炎、镇痛和抗血管生成以及抗糖尿病等多种药理作用。牛膝总皂苷(Achyranthes bidentata saponins,ABS)为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BI.)的主要活性成分,牛膝常被用作引药,能够引经报使,引诸药下行到达人体下半身,治疗人体下半身疾病的作用。课题组的前期实验结果证实:GE对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠有抗炎免疫调节作用,能够抑制AA大鼠FLS细胞增殖;下调AA大鼠FLS中白介素(interleukin,IL)-6、IL-17、干扰素-γ(Interferon-gama,IFN-γ)等炎性细胞因子的分泌水平,上调IL-4、转录生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等抗炎细胞因子的分泌水平;下调AA大鼠FLS中p38MAPK的磷酸化水平;ABS能够提高GE在AA大鼠关节腔组织中的靶向分布,对GE具有靶向引导作用。本课题采用AA大鼠模型,以RA的主要效应细胞FLS为研究对象,通过观察GE、ABS单用及合用对FLS功能的影响,探讨FLS表达F-actin水平的改变,研究Rho A调控p38MAPK/NF-κB/F-actin在AA大鼠FLS中的异常变化及作用机制,为中药有效成分的研究与应用提供更多的实验依据。目的:观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响;观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS分泌细胞因子水平的影响;观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65和F-actin蛋白表达水平的影响,为揭示F-actin参与RA异常炎症反应的病理机制,为中药有效成分对RA的预防与治疗提供新的研究思路。方法:Sprague-Dawley(SD)大鼠左后足足跖皮下注射弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)制备AA大鼠模型,于致炎后d7-d21进行大鼠全身评分、关节炎指数评分及足爪肿胀度测定。致炎后d21腹主动脉取血处死AA大鼠,组织块培养法培养FLS,传至第3代时,体外给药,分组情况如下:control组:空白的DMEM培养液,脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)组:5μg/m L LPS,GE单用组(25,50,100μg/m L),ABS单用组(40μg/m L),ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)及Rho A/ROCK抑制剂Y-27632组(10μM)。CCK-8法筛选出GE与ABS的给药浓度后,检测GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响;ELISA法检测各给药组对AA大鼠FLS细胞上清中IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1的含量的影响;蛋白质电泳法(Western-blot)法检测各给药组对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65及F-actin蛋白的表达量的影响。结果:1 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响GE体外刺激AA大鼠FLS细胞增殖的合适浓度为(25,50,100μg/m L),GE的亚适浓度(50μg/m L)与五个不同浓度的ABS合用刺激AA大鼠FLS细胞增殖后,选择40μg/m L作为ABS的给药浓度。与正常组相比,LPS组FLS细胞增殖亢进(P<0.01)。与LPS组相比,ABS单用组(40μg/m L)对LPS诱导的AA大鼠FLS细胞增殖能力无显著影响,GE单用组(25,50,100μg/m L)、ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对FLS的细胞增殖均有明显的抑制作用(P<0.05,P<0.01),Y-27632抑制剂组(10μM)亦可显著抑制FLS的细胞增殖能力(P<0.01)。ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)与GE单用组(25,50,100μg/m L)分别比较,ABS与中、高剂量GE合用组(40+50,40+100μg/m L)对FLS细胞增殖均有统计学差异(P<0.05)。2 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS分泌细胞因子的影响与正常组相比,LPS组FLS中IL-1和IL-17的分泌量明显上调,IL-4和TGF-β1的分泌量显著下调(P<0.01)。与LPS组比较,ABS单用组(40μg/m L)对AA大鼠FLS分泌的IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1无显著性差异;GE单用组(25,50,100μg/m L)、ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对AA大鼠FLS中IL-1、IL-17的分泌水平显著减少,IL-4、TGF-β1的分泌水平显著增加(P<0.05,P<0.01);Y-27632抑制剂组(10μM)对FLS中IL-1β、IL-17的分泌量亦显著降低,IL-4、TGF-β1的分泌量亦显著增多(P<0.01)。与GE单用组(25,50,100μg/m L)分别比较,仅ABS与中、高剂量GE合用组(40+50,40+100μg/m L)对FLS中IL-1β和IL-4的分泌水平有统计学差异(P<0.05)。3 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、NF-κB及F-actin蛋白表达的影响与正常组相比,LPS组FLS中的Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与LPS组比较,ABS单用组(40μg/m L)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平无显著性差异;GE单用组(25,50,100μg/m L)可显著下调AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK和F-actin蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),仅在GE中、高剂量组(50,100μg/m L)对NF-κB p-p65蛋白的表达水平有显著性差异(P<0.05,P<0.01);ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);Y-27632抑制剂组(10μM)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin蛋白水平亦显著性降低(P<0.01)。ABS与GE合用组与GE单用组分别比较,ABS的与中剂量GE合用组(40+50μg/m L)对AA大鼠FLS中p-p38MAPK和F-actin的蛋白表达水平有显著差异(P<0.05),ABS与高剂量GE合用组(40+100μg/m L)对FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表达水平均有显著差异(P<0.05)。结论:1.LPS组FLS细胞增殖亢进;FLS分泌的炎性细胞因子IL-1和IL-17水平明显增加,抑炎细胞因子IL-4和TGF-β水平明显降低;FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平均显著增加。2.GE能够显著抑制AA大鼠FLS增殖亢进,可明显降低AA大鼠FLS中炎性细胞因子IL-1β和IL-17的分泌水平,显著升高抑炎细胞因子IL-4和TGF-β1的分泌水平;可明显减少AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表达水平,阻断Rho A对p38MAPK/NF-κB/F-actin的调控,达到抑制AA大鼠FLS细胞增殖,恢复促炎细胞因子/抗炎细胞因子之间的动态平衡,抑制炎症发展的作用。3.ABS与低剂量GE合用(40+25μg/m L)时,对GE的抗炎免疫调节作用无显著影响,与中、高剂量GE合用(40+50,40+100μg/m L)时可增强GE的抗炎免疫调节作用。