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植物受到病毒系侵染后,会引发自身的免疫反应,可以免受同种病毒的其它株系侵染的现象称为交叉保护作用。利用弱病毒（弱毒疫苗）防治靶标强毒是目前防治植物病毒病的一种有效措施,但目前缺乏能够有效防治烟草病毒病的多联疫苗,也缺少一个能够在田间接种弱毒疫苗时具有高接种效率的接种体系。黄瓜花叶病毒（CMV）宿主广泛,为害严重,是弱毒疫苗基础病毒载体的一个理想选择。本研究是基于黄瓜花叶病毒创制不同类型的二价和三价弱毒疫苗,并进行接种方案和疫苗载体的优化。利用实验室已有的弱毒疫苗,进行喷雾接种方式、疫苗保质期、疫苗与肥料结合使用的三方面分析,对疫苗接种方案进行优化。农杆菌直接喷雾接种普通烟,接种成功率为12.5%,直接喷雾接种剪叶后普通烟,一次喷雾接种成功率为80%、两次喷雾接种成功率为100%,剪叶后1小时直接喷雾1次,接种成功率为100%,说明剪叶处理有利于疫苗接种。农杆菌加入金刚砂后喷雾接种未剪叶普通烟,接种成功率为93.3%,表明金刚砂的加入明显提升接种效率。普通烟叶片正面和背面分别进行喷雾接种成功率的差别不大。因此,合适的接种方式为农杆菌混合金刚砂,喷雾接种处于剪叶状态的普通烟叶片正面一次,加强接种一次。农杆菌菌体静置实验表明,常温静置3天以内,均可以成功接种本氏烟。疫苗与肥料混合实验表明,叶面肥的使用降低疫苗的防效,而生物有机肥、高钙钾镁肥的使用,则对疫苗的防效有加成作用。疫苗的田间接种建议方案如下:含有弱毒疫苗的农杆菌菌液混合金刚砂,在烟草剪叶处理后进行1到2次喷雾接种。所用农杆菌为新鲜制备3天内的菌液。接种疫苗后,可施用生物有机肥或高钙钾镁肥加强弱毒疫苗交叉保护的效果。在CMV的2b蛋白提前终止突变体pCCFR2-2b PTII的基础上,分别插入马铃薯X病毒（PVX）的不同区域100 bp、150 bp保守片段,获得4个PVX 100型插入突变体和4个PVX 150型插入突变体,这些突变体与野生型CMVFnyRNA1和CMVFnyRNA3混合接种本氏烟,结果显示:所有的PVX 100 bp、150bp保守片段插入型突变体的插入序列均稳定存在,且表现出弱致病症状,对CMV和PVX具备良好的交叉保护效果。同类型的两种、三种、四种疫苗的混合处理的交叉保护效果呈逐步上升趋势。以pCCFR2-2b PTII为基础载体分别插入马铃薯X病毒（PVX）/马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）/烟草脉带花叶病毒（TVBMV）、马铃薯Y病毒（PVY）/烟草脉带花叶病毒（TVBMV）三种组合,两种病毒各插入100 bp保守序列,获得3个三价弱毒突变体(pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989PY617-716、pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989TVB7600-7699和pCCFR2-2b PTII-PY617-716TVB7600-7699),这3个三价弱毒突变体分别与野生型CMVFnyRNA1和CMVFnyRNA3混合接种并测试对靶标病毒的防效,结果显示:三价弱毒突变体pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989PY617-716兼抗CMV和PVX,对PVY具有一定程度的预防效果;pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989TVB7600-7699兼抗CMV和PVX,对TVBMV防效不好;pCCFR2-2b PTII-PY617-716TVB7600-7699可预防CMV,对PVY和TVBMV防效不好。RNA病毒的RdRp的低保真性会造成某些突变的回复,对于弱毒疫苗的创制不利。针对这个问题,进行CMVFnyRdRp改造,以期获得高保真性RdRp并分析对突变的修复作用。将CMVFnyRNA2在RdRP（2a）编码框的第636位赖氨酸分别突变成丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸和色氨酸,获得4个突变体(pCCFR2-2a-A636、pCCFR2-2a-D636、pCCFR2-2a-R636、pCCFR2-2a-W636),将RdRp突变体分别与野生型CMVFnyRNA1、突变型CMVFnyRNA3混合接种,结果显示:所有RdRp突变体不能改变突变体pCCFR3-ΔCP180F突变回复率（100%）;RdRp突变体pCCFR2-2a-A636、pCCFR2-2a-D636不能改变突变体pCCFR3-TLSm1突变回复率（100%）;RdRp突变体pCCFR2-2a-R636、pCCFR2-2a-W636可降低突变体RNA3-TLSm1的回复率（从87.5%到75%、50%）。说明,通过改造RdRp可以一定程度上降低某些突变体的突变修复率,即体现一定程度的RdRp保真性的提高。本研究为基于CMV的多联弱毒疫苗创制及应用提供了研究材料和数据支持,为田间弱毒疫苗的接种提供方法依据,为植物病毒病的防治提供新的研究思路和技术支持。