刺参(Apostichopus japonicus)是我国著名的海珍品,一直是北方沿海增养殖的重要品种,也是近年来我国海水养殖单品种产值最高的种类之一。我国的刺参苗种繁育技术于上世纪80年代初步建立,经过数十年的发展,现已形成相对完整的技术体系,但面临的问题和挑战也日益凸显。本文针对目前刺参苗种生产中存在的突出问题,对亲参人工促熟技术、刺参受精生物学、微拟球藻的饵料效果、操作胁迫对幼参免疫的影响等进行了系统地研究。主要研究结果如下：1.不同培育水温和饲料对刺参的人工促熟效果实验分为两部分,第一部分研究了不同培育水温对刺参人工促熟的效果,第二部分研究了不同饲料对刺参人工促熟的效果。水温实验采用2种升温模式(从5-C逐渐升温至12℃后恒温培养和从5℃逐渐升温至15℃恒温培养)。饲料实验采用3种不同饲料(S组：鼠尾藻粉+海泥；L组：海带粉+海泥；SL组：鼠尾藻粉+海带粉+海泥)。实验过程中对刺参体壁粗成分(粗蛋白、粗脂肪、总碳水化合物)进行分析,实验结束后对雌性刺参性腺粗成分进行分析,同时检测雌参的性腺指数和平均排卵量、卵子卵径和受精率、受精卵孵化率、小耳幼体体长等指标。数据显示,在15℃温度培育下,雌参性腺中粗蛋白和粗脂肪含量分别为62.54+1.78%和10.83+1.04%,高于在12℃水温下培育的雌参。在15℃培育的雌参的性腺指数、排放率和平均排卵量分别为6.87+2.02%、16±2.31%和312±59.3×104粒,均高于在12℃培育的雌参。饲料实验中,S组和SL组的雌参性腺中粗蛋白含量分别为60.82±0.52%和59.18±1.26%,显著高于L组的雌参(PO<0.05),S组雌参性腺中粗脂肪含量为9.45±0.77%,高于L组和SL组的雌参。三种饲料投喂的雌参在性腺指数、排放率、平均排卵量等指标上差异不显著,但SL组的雌参以上三项指标值最高。SL组的亲参所产受精卵的孵化率和小耳幼体体长均显著高于L组饲料的亲参。研究结果说明,在相同的培育时间内,15℃恒温条件下培育的雌参繁殖力高于12℃件下培育的雌参,但两者排放的卵子质量没有显著差异；在实验范围内,投喂不同饲料的雌参繁殖力指标差异不明显,但SL组亲参所产受精卵孵化率和小耳幼体体长均高于S组和L组。2.刺参受精和早期卵裂过程的显微观察采用HOECHST 33258染色荧光显微观测的方法,对刺参的成熟卵子以及受精过程中精子入卵、极体排放、雌雄原核的形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞生物学过程进行了记录和分析。结果显示,刺参刚排出的成熟卵子处于第一次成熟分裂中期；在水温22℃～23℃、盐度30条件下进行人工授精,卵子受精后12min,完成第一次成熟分裂、释放第一极体；受精后20min,大部分受精卵完成第二次成熟分裂,放出第二极体；受精后35min,雌、雄原核开始在卵子中央发生染色体联合；受精后80min,部分受精卵完成第一次卵裂,受精后100min,部分受精卵完成第二次卵裂；刺参在受精过程中存在多精入卵现象。3.微拟球藻饲喂刺参浮游期幼体效果评价微拟球藻(Nannochloropsis sp.)是从福建海域中筛选出来的一种单细胞藻类。为检验该藻对刺参浮游幼体的饲喂效果,共进行了三个实验。实验一比较了7种饵料组合(C=牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri,D=盐藻Dunaliella tertiolecta,N=微拟球藻,CD=牟氏角毛藻+盐藻,CN=牟氏角毛藻+微拟球藻,DN=盐藻+微拟球藻,CDN=牟氏角毛藻+盐藻+微拟球藻)对刺参浮游幼体的投喂效果。受精后第9天的测定结果显示,投喂CD饵料的刺参幼体体长最长(1032.10±16.50μm),存活率最高(87.4±2.06%),投喂N饵料(微拟球藻)的刺参幼体体长为901.37±25.59μm。实验结束时,投喂N饵料的刺参幼体附着变态率为32.67±2.21%。实验二研究了不同投喂量的微拟球藻(5,000,20,000和40,000 cells mL1day-1)对刺参幼体生长、存活和附着变态的影响。日投喂量为20,000 cells mL-1的刺参幼体的体长显著高于其他两组(P<0.05),存活率也最高。日投喂量为20,000和40,000 cells mL-1的刺参幼体的附着变态率没有显著差异,均显著高于日投喂量为5,000 cells mL-1的刺参幼体。实验三比较了微拟球藻不同投喂频率(2、3和4次/天)对刺参幼体生长、存活和附着变态的影响。数据显示,授精后第9天,日投喂3次的刺参幼体体长最长,日投喂量为2次的幼体体长最小。日投喂3次和日投喂4次的刺参幼体在存活率和附着变态率上没有显著差异,均显著高于日投喂2次的幼体。实验结果表明,微拟球藻可以做为刺参浮游期的饵料,其最适日投喂量和投喂频率分别为20,000 cells mL-1和3次/天。4.机械胁迫对幼参的体腔液激素含量和免疫指标的影响对刺参幼参进行了模拟分筛操作,分别在实验开始前和实验开始后3min、0.5h、1h、2h、4h、8h和16h抽取刺参体腔液,测定体腔液中去甲肾上腺素和多巴胺含量、体腔液细胞浓度、细胞吞噬活性、呼吸爆发活力以及酸性磷酸酶和酚氧化酶活性。结果显示,经过3min的机械胁迫,刺参体腔液中去甲肾上腺素和多巴胺含量分别增加到初始值的7倍和3倍.胁迫结束后逐渐降低,2h后恢复到初始水平。胁迫开始后,体腔液中体腔液细胞浓度逐渐升高,1h后达到最大值16.16×106 cells mL-1,显著高于初始值(P<0.05),4h后恢复到初始水平。整个实验过程中,体腔液细胞吞噬活性、呼吸爆发活力、酸性磷酸酶活性和酚氧化酶活性都呈胁迫开始后降低,胁迫结束时显著低于初始水平,胁迫结束后上升,之后开始回落的趋势。至实验开始8h后,各项免疫指标均恢复到初始水平。实验表明,幼参存在明显的应激反应,通过分泌儿茶酚胺类激素调节免疫功能对胁迫做出应答。5.不同运输方式对剌参幼参的体腔液激素含量和免疫指标的影响通过测定湿运和水运两种运输方式下,刺参体腔液内去甲肾上腺素和多巴胺水平、总细胞数、细胞吞噬活性、呼吸爆发活力、酸性磷酸酶活性和酚氧化酶活性等指标的变化,研究了运输胁迫对刺参免疫的影响。在湿运法中,运输开始后刺参体腔液中去甲肾上腺素和多巴胺浓度逐渐上升,分别在1h和0.5h达到初始值的6倍和3倍,运输结束后,两者回落到初始水平。运输开始后,体腔液内总细胞数逐渐上升,0.5h时达到20.37×106 cells mL-1,显著高于初始值,此后维持此水平一直到8h。细胞吞噬活性和呼吸爆发活力运输期间显著下降,分别在1h和0.5h到达最低值(6.18±1.54%和0.14×0.02 106 cells mL-1),运输结束后两者开始上升,至4h时上升到最大值(20.47±1.94%和0.32×0.03 106 cells mL-1),并且显著高于初始水平,此后逐渐恢复到初始水平。运输期间,酸性磷酸酶活性和酚氧化酶活性显著下降,运输结束后两者逐渐恢复到初始水平。在水运法中,运输开始后刺参体腔液中去甲肾上腺素和多巴胺浓度逐渐上升,在1h时分别达到初始值的2.3倍和1.7倍,运输结束后,两者回落到初始水平。运输开始后,体腔液内总细胞数开始上升,在1.5h至4h间一直显著高于初始水平,8h时恢复至初始值。细胞吞噬活性和呼吸爆发活力在运输开始后逐渐下降,分别在3h和1.5h显著低于初始值,运输结束后恢复到初始水平。在水运法中,刺参体腔液中酸性磷酸酶和酚氧化酶活性没有显著变化。实验结果表明,运输过程中,刺参免疫系统产生应激反应,湿运法对刺参产生的胁迫比水运法更为严重。