粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和大肠杆菌鞭毛蛋白（FliC）是两种来源不同的免疫佐剂,GM-CSF属于细胞因子佐剂,FliC属于微生物成分佐剂。GM-CSF作为佐剂具有高效、迅速、持续期短等特点;FliC作为佐剂具有安全、毒性低、持续期较长等特点。针对GM-CSF和FliC的优势,本研究以猪GM-CSF和大肠杆菌FliC作为研究对象,评价二者在小鼠上作为复合生物佐剂时,对口蹄疫与塞内卡灭活疫苗免疫效果的影响。本研究根据 GenBank 上登录的猪 GM-CSF（DQ108393.1）、FliC（JX847136.1）基因序列,进行信号肽的预测,将预测到的信号肽部分去除后,在不改变氨基酸序列的条件下,按照大肠杆菌偏爱性的密码子进行优化。优化好的基因序列合成到表达载体pET-32a（+）上,转化到Ecoli BL21感受态细胞中。构建好工程菌后,对其进行诱导表达、Western blot鉴定、表达条件优化、可溶性分析以及纯化和复性。结果表明,重组猪GM-CSF蛋白的分子量约为32 kDa,主要以包涵体形式表达,诱导时间3 h,IPTG的浓度为1.0 mmol时表达产量较优,纯化后条带单一,纯化效果良好。重组FliC蛋白分子量约为75 kDa,主要以可溶形式进行表达,诱导时间4 h,IPTG的浓度为1.2 mmol时表达产量较优,随后进行纯化,纯化效果较好。将制备好的重组蛋白与口蹄疫灭活疫苗混合后免疫小鼠,利用间接ELISA和RT-qPCR对口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体水平和脾脏细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10相对表达量进行检测。ELISA检测表明GM-CSF佐剂组和FliC佐剂组的抗体水平高于FMD疫苗组,复合佐剂的抗体水平高于FMD疫苗组和其他佐剂组。RT-qPCR检测结果显示,GM-CSF佐剂组、FliC佐剂组与复合佐剂组中4种细胞因子的相对表达量均高于疫苗组和PBS组。将塞内卡（1.0×108 TCID50）细胞毒用甲醛灭活后,制备塞内卡灭活疫苗。将制备好的塞内卡灭活疫苗与重组蛋白混合后免疫小鼠,利用间接ELISA和RT-qPCR检测塞内卡病毒VP2结构蛋白抗体水平和脾脏细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10相对表达量。ELISA检测显示,复合佐剂组抗体水平较高,其次是GM-CSF佐剂组、FliC佐剂组,三个佐剂组的抗体水平都高于SVA疫苗组和PBS组。RT-qPCR检测结果表明,复合佐剂组中4种细胞因子的相对表达量均高于GM-CSF佐剂组、FliC佐剂组,且三个佐剂组的相对表达水平都高于SVA疫苗组和PBS组。综上所述,重组猪GM-CSF蛋白和重组FliC蛋白,单独或联合使用均能提高口蹄疫、塞内卡灭活疫苗的免疫应答水平,且重组蛋白联合使用效果更佳。