论文部分内容阅读
哺乳动物卵巢卵母细胞发育的研究，最初主要关注生殖细胞形成的早期阶段或出生后卵泡的生长发育。而原始卵泡的体外形成与发育激活方面，虽然有小鼠原始卵泡体外培养发育并可获得成熟的卵母细胞的报道，但减数分裂前的雌性生殖细胞不能在体外完成这一卵母细胞发生与成熟的整个发育过程，其原因至今不甚清楚。鉴于此，本研究使用了本实验室建立的减数分裂前的生殖细胞体外发育的培养体系，将12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴中的减数分裂前的生殖细胞体外培养28天以后获得GV期的卵母细胞，并通过亚硫酸盐测序法检测了这些卵母细胞在体外培养过程中的DNA甲基化进程，探讨卵母细胞印迹基因DNA甲基化与卵母细胞体外发育阻滞的关系。
本研究首先是对12.5dpc胎鼠生殖嵴进行了体外培养，培养到7d时，出现圆形生殖细胞;14d时，出现典型的初级卵泡结构;21d时，卵母细胞直径可达60μm，由颗粒细胞包裹，由于卵泡膜细胞的出现，此时已经形成了明显的卵泡结构，但颗粒细胞增殖缓慢，只有2-3层，并且没有卵泡腔的出现;27d时，卵母细胞直径最大可达70μm以上;28d时，一些卵母细胞能够自发的从体外培养的组织中游离出来，并且具有明显的透明带和生发泡结构。其卵母细胞发育的各个时期，卵母细胞印迹基因Igf2r（Peg3）甲基化比例分别为6.3％、12％、9.3％和42.67％（3.3％、5.6％、4.4％和21.67％）;对照组卵母细胞分别来自于体内0、7、14和21dpp的新生鼠卵巢，其甲基化比例分别为5.6％、52.7％、80.1％和95.33％（2.2％、33.3％、76.7％和88.98％）。由上述可见，印迹基因Igf2r和Peg3甲基化印迹的建立在卵母细胞体内生长和体外培养过程中存在一定差异。
为了进一步了解12.5dpc胎鼠生殖嵴体外培养获得的卵母细胞印迹基因甲基化模式的建立过程，本研究分析了卵母细胞直径与印迹基因DNA甲基化的关系。将体外培养28d获得的卵母细胞分成30-45μm、45-60μm和60-75μm三组，其印迹基因Igf2r和Peg3的甲基化比例分别为17.33％、33.33％和94.44％（11.1％、26.11％和45％），这表明在体外随着卵母细胞直径的不断增加，Igf2r和Peg3基因的DNA甲基化比例不断提高。相关性分析表明，卵母细胞甲基化进程与直径之间存在强正相关。另外，在相同直径下，体外培养卵母细胞印迹基因DNA甲基化进程要慢于体内发育。
本研究中还检测了颗粒细胞增殖和分化前后，即初级卵泡向次级卵泡转变过程、卵泡腔形成过程对卵母细胞印迹基因甲基化状况的影响。颗粒细胞增殖前后卵母细胞Igf2r和(Peg3）甲基化比例分别为58.67％和61.25％（40.56％和42.22％）;分化前后分别为86.67％和89.67％（86.67％和88％）。由上述可见，颗粒细胞的增殖与分化对直径大致相同的卵母细胞印迹基因甲基化没有影响。