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背景杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种X连锁隐性遗传病,临床症状表现为肌肉的进行性加重的损伤,且具有致死性。全世界每年约5000个新生儿中就有1个患病。该病的致病基因是DMD基因,其突变会导致抗肌萎缩蛋白(dystrophin)不能够正常合成,影响了该蛋白的正常功能进而引起肌肉损伤,导致疾病的发生。近些年来,随着对基因的研究的不断深入,DMD基因疗法逐渐产生并发展壮大。DMD非常适合使用基因疗法治疗。一方面是由于单个基因即DMD基因突变引起的疾病,在治疗时只需要考虑该致病基因即可。另一方面,由于肌肉细胞不分裂,寿命长,一次性的治疗可能带来长期甚至终生的益处。DMD的基因治疗旨在从基因层面根本上对DMD进行治疗。具体来说则是通过引入基因片段对突变或缺失的肌营养不良蛋白基因进行修复,恢复肌营养不良蛋白基因的功能,使骨骼肌、膈肌、心肌的肌肉功能恢复正常。合适的病毒转运载体是利用CRISPR/Cas9技术对DMD患者进行基因治疗的关键一步。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种非病原性的人类缺陷病毒,是目前遗传病基因治疗的理想载体。其中腺相关病毒9型(adeno-associated virus serotype9,AAV9)分离自非人灵长动物,具有极低的免疫原性和毒性。AAV9介导的CRISPR/Cas9基因编辑作为DMD治疗的重要方法,也面临着相比其他疗法更为独特的挑战。虽然AAV9应用于DMD基因治疗已有一定成就,但AAV9在动物体内长期分布情况及安全性问题仍然缺乏相关研究。本研究中以小鼠为研究对象,分析不同注射方式、不同病毒滴度的AAV9病毒载体在小鼠体内的分布及表达情况,选出合适的病毒注射方式及剂量。并研究该注射方式和剂量下的AAV9病毒在小鼠体内的长期分布情况;最后通过解剖小鼠制作器官组织的病理切片对AAV9在小鼠体内的安全性进行分析。为后续探索基因治疗安全性研究提供实验基础。目的1.分析注射方式、注射剂量对AAV9病毒载体在小鼠体内的分布及表达情况的影响,初步选定注射方式及剂量。2.分析合适注射方式和剂量时AAV9病毒载体在小鼠体内的长期分布情况以及安全性。方法1.通过尾静脉注射和肌肉注射两种方式,向雄性Balb/c小鼠分别注射不同滴度的携带Luciferase荧光报告基因的AAV9病毒(AAV9-Luc),正常饲养3天后,于生物荧光成像仪下观察在小鼠体内的表达情况。2.用前期实验确定的注射方案向雄性Balb/c小鼠注射AAV9-Luc,正常饲养30天后,于生物荧光成像仪下观察小鼠体内荧光的表达情况以及具体各个器官的荧光分布情况。3.采用前期实验确定的注射方式和注射剂量向雄性Balb/c小鼠注射AAV9-Luc,正常饲养14天后,观察小鼠器官的形态学大体变化以及病理切片的镜下形态变化。结果1.本研究发现尾静脉注射AAV9时,病毒可在小鼠体内均匀且广泛的分布和表达。当肌肉注射中剂量(4×1011VG/只)时,病毒表达局限在注射部位局部及四肢、膈肌等肌肉组织中,其他脏器未见明显表达。2.选择肌肉注射中剂量为注射方式和适合剂量,在30天的长期分布研究中,随着时间的延长,荧光的表达量逐渐增大,表达部位从局限于右后肢注射处渐渐扩大,且未见肌肉以外地其他器官有明显荧光表达。右后肢肌、右前肢肌中的荧光表达量随着时间的增加逐渐增大。3.AAV9病毒注射小鼠后,动物的主要脏器(肝、脾、肺、肾、胰、脑、睾丸),主要肌肉(四肢肌、膈肌、肋间肌、心肌)肉眼观察形态均正常。没有出血、坏死、肿大、萎缩等异常现象。结论肌肉注射剂量为4×1011VG/只AAV9病毒时,病毒在小鼠体内局限分布于肌肉,而在非肌肉器官中几乎没有分布,是较为合适的注射方式和剂量。且该剂量时通过肌注时对于小鼠较为安全。