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由丝状子囊真菌稻瘟病菌[Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr]侵染水稻引起的稻瘟病是水稻上的一种毁灭性病害。深入了解稻瘟病菌的致病相关基因及致病机制,对寻找新的药物靶标,设计开发和筛选新型、安全、环保的杀菌剂,制定新的病害防治策略具有重要意义。本文从农杆菌介导的稻瘟病菌遗传转化突变体库中分离和鉴定了一个Duolp同源蛋白MoDuolp,利用基因缺失、功能互补及蛋白组学策略研究了MoDuolp编码基因MoDUO1在稻瘟病菌营养生长、分生孢子发育、致病性等方面的作用。
通过筛选稻瘟病菌农杆菌介导的插入突变体库(ATMT)获得一个稻瘟病菌营养生长减缓、分生孢子形态异常突变体YO552,经质粒拯救、T-DNA插入侧翼序列测定及基因组全序列比对,发现转化T-DNA插入在稻瘟病菌假定蛋白基因MGG_02484.6内含子区域,该基因有两个外显子,一个内含子,编码226个氨基酸残基蛋白,NCBI保守结构域分析显示,该基因推定的氨基酸序列含有一个DASH_DUO1结构域,在真菌中高度保守,我们将该基因暂命名为MoDUO1。
以MoDUO1-eGFP融合表达对该基因的亚细胞定位及时序表达分析显示,MoDUO1蛋白定位于细胞质中,并在营养菌丝、分生孢子、附着胞及侵染性菌丝等不同发育阶段均有表达。在分生孢子萌发初始阶段,仅在细胞核中发现了该蛋白。用同源重组的方法将该基因缺失,基因缺失突变体在营养生长、无性分生孢子发育上呈现严重的缺陷。MoDUO1基因的敲除极度地影响了病原菌无性孢子的形态和生理,包括分生孢子梗分化和分生孢子形态的改变;分生孢子细胞核数量减少;萌发率下降以及侵染性菌丝扩展的延迟。同时,MoDUO1基因缺失突变体对水稻致病性明显减弱。利用互补载体pCDUO1转化MoDUO1基因缺失突变体,互补株均恢复为野生型。
利用2-DE和质谱技术分析了野生型Y34和MoDUO1基因缺失突变体总蛋白表达谱,获得70个差异表达蛋白质,其中四个分别编码Cdc48p、26S蛋白酶体调控亚基、Ran特异性GTP酶活性蛋白、核内GTP结合蛋白GSP1/Ran的下调表达蛋白,与MoDUO1相似,均参与了细胞有丝分裂调控。本研究结果表明,MoDUO1基因编码一个新的稻瘟病菌DASH复合体成分,是稻瘟病菌营养生长、分生孢子发育及致病性相关基因。