目的:1.基于DNA三维步行器引发RCA@HCR核酸级联扩增反应系统,构建一种新型的级联增敏电化学生物传感器,并将其应用于E.coli O157:H7的超灵敏检测。探讨该级联增敏电化学生物传感器的分析测试性能,包括灵敏度、特异性、重复性和稳定性等。2.基于自制磁控电化学流动检测池,综合C₆₀@Au NPs纳米复合材料和核酸HCR反应优良的信号放大效率,构建高灵敏、高特异双组份磁控电化学生物传感器,并用于病原微生物E.coli O157:H7和Vibrio cholerae O1的并行检测。方法:1.在玻碳电极表面电沉积纳米金,并对电沉积时间（5 s¹00 s）进行优化,采用扫描电子显微镜JSM-4800对电沉积纳米金的形貌进行表征鉴定,确定最佳电沉积时间,并进一步采用原子力显微镜对电沉积纳米金的形貌进行表征。2.采用系列实验对比研究不同信号放大策略的电化学响应,考察实验研究所设计的信号放大策略的放大效果,对比试验研究包括以下三组:（1）HCR扩增反应,并以生成的双链DNA结构固载电子媒介体Fc-Dox;（2）RCA扩增反应,采用辅助序列与反应获得的单链DNA序列杂交形成双链DNA以固载电子媒介体Fc-Dox;（3）RCA@HCR级联反应,采用RCA扩增反应所生成的重复序列进一步引发HCR扩增反应,进而采用形成的双链DNA结构固载电子媒介体Fc-Dox。3.构建用于E.coli O157:H7病原菌快速检测的级联增敏电化学生物传感器技术,根据电化学生物传感器电流响应信号的变化与E.coli O157:H7病原菌浓度之间的对应关系,探讨级联增敏型电化学生物传感器E.coli O157:H7病原菌检测技术的线性范围、特异性、重复性及稳定性等基本参数。4.为改变现今常规电极制备工艺复杂、生产成本高、难以再生循环使用等缺点,自主设计研发一种新型的磁控电化学流动池检测系统,通过流动池辅助磁体固定磁珠于电极表面进行相关电化学传感分析检测,并在检测完成后,移去磁体,洗涤去除吸附于电极表面的磁珠,以进行下一次检测,拟实现目标物识别过程及检测过程的有效分离,同时解决电极制备工艺复杂和难以再生循环使用等问题,极大程度地提高检测效率。5.为考察实验研究所采用的纳米复合材料结合HCR核酸扩增放大策略的效果,本文采用三种不同的信号放大策略,对比研究每种方法的实际信号响应效果,具体如下:（1）直接采用Pb S或CdS纳米颗粒修饰检测抗体;（2）AuNPs+HCR扩增放大策略;（3）C₆₀@AuNPs纳米复合材料+HCR扩增放大增强策略。6.基于自主研发的磁控电化学流动池检测系统,结合C₆₀@Au NPs优良的固载性能和HCR扩增放大效率,构建特异性好、灵敏度高的双组份磁控电化学生物传感器,对E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1病原菌进行并行检测。根据磁控电化学生物传感器阳极溶出伏安法（ASV）电流响应信号的变化与E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1病原菌浓度之间的对应关系,探讨双组份磁控电化学生物传感器检测技术的线性范围、特异性等基本参数。采用双组份磁控电化学生物传感器和平板培养计数法技术对临床标本中E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1病原菌的浓度进行检测,探讨双组份磁控电化学生物传感器用于临床标本检测的可行性。结果:1.采用扫描电子显微镜对电沉积纳米金的形貌进行表征鉴定,结果表明:在电沉积时间5¹00 s范围内,随着电沉积时间的增加,纳米金颗粒逐渐增大、增多;当电沉积时间大于30 s时,电沉积纳米金颗粒基本铺满玻碳电极片表面,并出现花状纳米金颗粒聚集体,且随着电沉积反应时间的增加而增多。基于实验结果,综合考虑纳米金形貌及纳米金修饰对于电极表面积增加效果,实验研究采用30 s作为电沉积纳米金最佳反应时间用于级联增敏电化学传生物感器的构建。同时采用原子力显微镜对电沉积纳米金形貌表征鉴定结果表明,电沉积得到的纳米金粒径均一,且均匀分布于玻碳电极片表面。2.对比研究不同信号放大策略的电化学响应结果表明,在最佳实验条件下,单独采用HCR反应实现信号放大,其电化学响应信号为2.95?A;仅采用RCA扩增反应实现信号放大,其电化学响应信号为3.14?A;采用以RCA@HCR为基础的级联扩增放大技术,其电化学响应信号明显增强,达5.25?A。说明,以RCA@HCR反应为基础的级联扩增放大技术具有较好的信号放大效果,能够有效地增加电子媒介体Fc-Dox的固载,进而提高电化学传感器电化学响应信号。3.级联增敏电化学生物传感器E.Coli O157:H7检测技术在1.0?10¹¹.0?10⁴CFU/m L范围内,电子媒介体Fc-Dox的DPV峰电流强度与目标物核酸浓度呈良好的线性关系,线性方程为y=0.9803 lgc_{E.Coli O157:H7}+5.73,其检测下限为7 CFU/m L。将本研究的电化学分析检测技术与部分文献研究报道的方法进行对比,结果表明所构建的电化学传感技术具有较好的线性范围及灵敏度等。4.通过所构建的级联增敏电化学传生物感器对系列不同核酸序列,包括单碱基、多碱基差异核酸的分析检测表明,所测定的干扰核酸序列均无明显干扰,说明本文所构建的电化学传感器具有良好的特异性。对相同批次和不同批次的电极重复性以及长时间稳定性进行研究,其批内、批间标准差均小于5%,稳定性测试标准偏差小于5%,说明所构建的级联增敏电化学传生物感器具有良好的重复性和稳定性。5.成功构建磁控电化学流动池检测系统,其主要构件包括有机玻璃体外腔、限位盘、限位盘固定螺杆、电极片、永磁体、永磁体固定螺杆、密封圈、对电极、参比电极等。6.在本体系优化的最佳实验条件下,直接采用Pb S或Cd S纳米颗粒修饰检测抗体所获得的检测电流响应分别为4.29?A和4.64?A;结合Au NPs+HCR扩增放大策略,其检测电流响应明显增大,分别为9.82?A and 11.13?A,表明核酸扩增放大策略能够有效提高电化学分析检测信号;采用实验研究设计的C₆₀@Au NPs纳米复合材料增强+HCR扩增复合增强策略,其检测电流响应达到19.19?A和22.11?A,表现出优良的信号放大增强效果。7.双组份磁控电化学生物传感器分析检测技术,在5?10¹¹?10⁶ CFU/m L范围内,电化学电流响应信号强度与目标物E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1浓度呈良好的线性关系,?I（μA）=3.43logc_O157:H7-5.05和?I（μA）=3.51logc_O1-4.54,其检测下限分别为39 CFU/m L和32 CFU/m L。同时,将该实验方法与我们前期研究成果及目前已经报道的方法相比较,表明本实验研究的双组份电化学传感技术具有较好的分析检测性能。同时双组份电化学传感技术具有较好的重复性、稳定性。8.采用双组份磁控电化学生物传感器和平板培养计数法技术对临床标本中E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1病原菌的浓度进行检测,对两种方法检测结果的一致性进行分析,结果表明两种方法的检测结果无显著性差异。结论:1.以DNA三维步行器引发RCA@HCR核酸扩增反应为基础的级联扩增放大技术,能实现核酸序列的三重放大,反应构筑的核酸树形分子可高效固载电子媒介体Fc-Dox,提高电化学传感器电化学响应信号,进而提高了电化学传感器的分析测试性能。2.利用DNA三维步行器引发RCA@HCR核酸扩增反应的核酸级联增敏系统,结合电化学生物传感器响应迅速、检测时间短的特点,成功建立了用于E.coli O157:H7病原菌高灵敏、快速检测的电化学生物传感器技术。该电化学生物传感器为病原微生物感染的早期诊断提供了一种全新的方法。3.本文自主研发设计了一种新型的磁控电化学流动池检测系统,通过流动池辅助磁体固定磁珠于电极表面进行相关电化学传感分析检测,并在检测完成后,移去磁体,洗涤去除吸附于电极表面的磁珠,以进行下一次检测,实现了目标物识别过程及检测过程的有效分离,极大程度地提高了检测效率。另外,该流动池具有结构简单、便于制备、通用性好等优点,能够有效地实现各种目标物检测系统的协调应用。4.在自制磁控电化学流动池检测系统的基础上,综合C₆₀@Au NPs纳米复合材料优良的电化学信号物质固载性能和核酸HCR反应良好的信号放大效率,构建了一种高效、高灵敏的双组份磁控电化学生物传感器分析检测技术。5.采用双组份磁控电化学生物传感器分析检测技术可实现E.coli O157:H7和Vibrio cholera O1病原菌的并行检测,该技术具有较好的分析检测性能。同时双组份磁控电化学传感技术具有较好的特异性、重复性、稳定性。为多重病原微生物感染的早期诊断提供了一种全新的探索与尝试。