青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)的克隆、表达、和功能研究

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青海湖裸鲤是分布于青海湖及其周边流域的唯一的经济鱼类,在鱼-鸟-草地生态系统中处于核心地位。开展青海湖裸鲤基础生物学特征和适应低氧、低温、高盐度的分子机理的研究,有助于揭示青海湖裸鲤的基本生命活动规律,为该鱼种的资源保护和人工增殖放流提供理论依据。为了在基因功能研究中得到可靠地内参基因,我们通过RT-PCR和RACE方法得到了青海湖裸鲤三磷酸甘油醛脱氢酶(Gp-GAPDH)基因两种异形体的完整编码序列,分别命名为Gp-GAPDHα (JX287372)和Gp-GAPDHβ(JX287373),同时对于Gp-GAPDHα和Gp-GAPDHβ在不同的组织和受精卵发育不同阶段的表达量进行研究,发现Gp-GAPDHα与Gp-GAPDHβ在青海湖裸鲤不同组织和受精卵发育不同阶段表达量存在较大差异,尤其Gp-GAPDHβ在受精卵发育不同阶段差异显著。初步断定Gp-GAPDHβ不适合作为参照基因,而Gp-GAPDHα表达稳定性需要进一步研究,选择其作为参照基因需谨慎。钙调蛋白磷酸酶(CN),是由催化亚基(CN A)和调节亚基(CN B)组成的异二聚体的蛋白酶,它在多项生理过程中发挥重要作用,是一个多功能的信号酶,它可被Ca2+和钙调蛋白所激活。我们从青海湖裸鲤鳃组织通过RT-PCR和RACE方法克隆得到了CN A的两个旁系同源体(GpCAα andGpCAγ)基因序列以及CN B序列,通过real time方法研究了其在胚胎发育不同阶段和盐度适应过程中的表达模式,同时通过免疫组化方法确定了其在肾脏、心脏、脑子、精巢和鳃等不同组织中的分布特征。结果发现,青海湖裸鲤卵细胞受精后,GpCAα、GpCAγ和GpCB三种基因都在胚胎发育中持续性表达,同时表现为先降后升的趋势,GpCAα和GpCB在神经胚期表达量达到最小,相比之下,GpCAγ则在原肠胚期表达量最少。在盐度的适应过程中,GpCAα和GpCAγ表达量随着盐度的逐渐升高而升高,而GpCB表达量在胁迫初期升高之后却有下降的趋势。通过免疫组织化学方法确定了CN在青海湖裸鲤肾、心脏、脑子、精巢和鳃丝中特殊位置存在表达。通过此次研究可以推测,CN在青海湖裸鲤胚胎发育、盐度胁迫适应过程及各组织功能维持中起着重要的作用。研究结果为进一步了解CN的作用及其机理提供了基本资料,同时为青海湖裸鲤的增殖放流工作起着指导作用。
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