主要由大丽轮枝菌（V.dahliae）引起的棉花黄萎病是一种土传真菌病害,是生产上最重要的病害之一,几乎遍及全球各主要棉区,造成严重的经济损失。种植抗病品种是防治棉花黄萎病的一种有效措施,目前生产上尚缺乏高抗棉花黄萎病品种。由于田间棉花黄萎病菌是一个致病力高度分化的群体,且致病力容易变异,出现强致病力的类型,以及棉花品种抗病性不稳定性,导致我国主要产棉区棉花黄萎病普遍发生。棉花黄萎病菌作为典型的土传性病原真菌,致病机理复杂。近年来,尽管国内外有关黄萎病菌致病机理研究取得一定进展,但同其他植物病原真菌相比,其致病机理的研究相对滞后。而深入研究黄萎病菌致病及微菌核形成的分子机理,鉴定出控制致病性的关键基因,有助于揭示其致病机制,为防治棉花黄萎病菌新型杀菌剂的设计和筛选提供候选靶标。1.本研究对实验室构建的T-DNA插入转化体库进行筛选,对随机挑选的部分转化子在生物学方面进行测定,获得了在菌落生长速度、微菌核产生能力、产孢量、致病性等方面的突变体。根据菌落培养特征,将转化子分为菌核型,菌丝型,中间型三种类型。结果显示:在调查的192株转化子中,大部分转化子25℃PDA培养基上的菌落形态与野生型无明显的差异,占调查转化子总数的71.88%,属于菌核型。47株转化子微菌核产生能力明显减弱,占调查转化子总数的24.48%,属于中间型。7株转化子完全不产微菌核,分别为V874-2-1,V923-1-2,V923-1-1,V534-1,V966-1,V909-1,V945-1,属于菌丝型。菌落生长速度测定结果表明大多转化子的生长速度与野生型菌株FGH₂无明显的差异,16株转化子生长速度较野生型明显减慢。产孢量测定结果显示,产孢量显著减少的突变体有34株,占总数的17.7%,产孢量显著增加的有14株,占总数的7.29%。致病力测定结果显示,95株转化子的致病性与野生型菌株FGH₂无显著性差异,病情指数均在80以上。致病力明显减弱的转化子有8株,病情指数均在50以下,分别为V923-1-1,V898-1,V782-1,V700-1,V923-2,V641-1,V835-1,V910-1。2.实验室前期获得两株黄萎病菌T-DNA插入突变体,突变体V1009致病力明显减弱且微菌核形成能力减弱,突变体V546致病力明显减弱且微菌核形成能力丧失。前期研究表明T-DNA分别插入在大丽轮枝菌基因VDAG₀1673.1与VDAG₀7282.1的编码区。基因VDAG₀1673.1编码过氧化物酶体膜蛋白Pex16,基因VDAG₀7282.1编码一个未知功能的蛋白。本研究采用Split-Marker法,以潮霉素基因为选择标记基因构建了这两个基因的敲除载体。同时,以含有潮霉素基因和新霉素基因的载体pKOV21为基础,通过酶切连接的方法,将基因PEX16和基因VDAG₀7282.1的上下游序列分别与潮霉素基因的上下游序列相连,分别获得基因PEX16的敲除载体p1009KOV21和基因VDAG₀7282.1的敲除载体p546KOV21。为致病相关基因的敲除奠定了基础。3.本研究利用崩溃酶（driselase）和溶壁酶（lysing enzymes）对黄萎病菌新鲜的菌丝进行酶解,可以获得大量的原生质体,为PEG-CaCl₂介导的遗传转化提供了条件。