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目的:优选黄芪多糖半仿生提取法的最佳工艺,分析半仿生提取醇沉工艺和水提醇沉工艺所得的黄芪多糖,在多糖均一性、分子量以及对胃粘膜损伤保护作用的差异,并初步探讨其作用机制。方法:以黄芪总多糖提取率、提取收率及总皂苷提取收率为考察指标,采用正交实验优化半仿生提取最佳工艺,并与传统水提工艺进行比较。采用Sevag去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析对传统水提醇沉法与半仿生提取醇沉法处理得到黄芪多糖,采用高效凝胶渗透色谱法(GPC)检测两种工艺所得黄芪多糖的均一性及分子量的差异。比较两种提取工艺得到的黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导大鼠胃粘膜损伤的保护作用。研究半仿生提取醇沉工艺获得的黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导大鼠胃粘膜损伤的保护作用,并从胃粘膜组织中凋亡信号通路Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达探讨治疗作用机制。结果:1、正交实验优化黄芪多糖半仿生提取法工艺:以黄芪总多糖提取率(p/%)、总皂苷提取率(P/%)、提取收率(P/%)作为指标;①在模拟胃液提取条件下,贡献度加权分析结果显示,贡献度大小由大到小依次是提取温度(28.9)>料液比(12.8)>提取时间(1.5)。其中料液比(P<0.05)和提取温度(P<0.01)起主要作用,均具有统计学差异(P<0.05),提取时间作用次之,无统计学差异(P>0.05)。②在模拟肠液提取条件下,贡献度加权分析结果显示,加权后贡献度大小由大到小依次是料液比(49.6)>提取温度(12.8)>提取时间(4.0)。其中料液比(P<0.01)和提取温度(P<0.05)起主要作用,均具有统计学差异(P<0.05),提取时间作用次之,无统计学差异(P>0.05);实验结果:结合经济效益,半仿生提取法优选工艺为模拟胃液为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间1h;模拟肠液为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间1 h。2、两种工艺得到的黄芪多糖在均一性及分子量的比较:两种提取工艺得到的黄芪多糖均为非均一多糖,两者之间在分子量上存在差异,半仿生提取法的分子量分布约在3万-670万之间,且其低分子量段含量稍高于高分子量段多糖,而传统水提法的分子量分布约为5万-1670万,其高分子量段含量远高于其他分子量段多糖。提示半仿生提取获得的多糖在分子量方面与传统水提法获得的多糖是有明显的区别。3、两种工艺得到的黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤保护作用观察:①乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤保护实验结果显示,与模型组比较,半仿生提取醇沉黄芪多糖组大鼠的胃粘膜损伤评分明显降低均有统计学差异(P<0.05)。与水提取醇沉黄芪多糖组比较,半仿生提取醇沉黄芪多糖组的大鼠胃粘膜损伤分值明显降低均有统计学差异(P<0.05)。②吲哚美辛诱导大鼠胃粘膜损伤实验结果显示,与模型组比较,水提醇沉黄芪多糖组、半仿生提取醇沉黄芪多糖组大鼠的胃粘膜损伤评分显著性降低,具有统计学差异(P<0.05)。与水提醇沉黄芪多糖组比较,半仿生提取醇沉黄芪多糖组的大鼠胃粘膜损伤分值降低无统计学差异(P>0.05)。实验结果提示,半仿生提取工艺获得的黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤均有保护作用,且优于传统水提工艺的黄芪多糖,4、半仿生提取醇沉黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导大鼠胃粘膜损伤的形态学影响:①在乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的保护实验中,半仿生提取醇沉黄芪多糖高、低剂组均能显著降低胃粘膜的损伤分数,均具有统计学差异(P<0.05),高剂量组效果明显优于低剂量组。②在吲哚美辛诱导大鼠胃粘膜损伤的保护实验中,半仿生提取醇沉黄芪多糖高剂量组大鼠的胃粘膜损伤评分显著降低,具有统计学差异(P<0.05),低剂量组无明显保护作用。实验结果提示,半仿生提取醇沉黄芪多糖对乙醇及吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤具有明显的保护作用,且有剂量关系。5、半仿生提取醇沉黄芪多糖对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤保护作用的机制研究:通过免疫组化检测抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达情况,与正常对照组比较,模型组大鼠胃粘膜组织中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达降低有统计学差异(P<0.05),促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达增强有统计学差异(P<0.01)。说明模型的抑凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达升高。与模型对照组比较,半仿生提取醇沉黄芪多糖高、低剂量对胃粘膜组织中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达增强有统计学差异(P<0.01),促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达降低有统计学差异(P<0.05和P<0.01)。结果提示,半仿生提取醇沉黄芪多糖对乙醇诱导大鼠胃粘膜损伤的保护作用是通过凋亡信号途径,即升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达,发挥对胃粘膜损伤的保护作用。结论:黄芪多糖半仿生提取的优选工艺条件为模拟胃液为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间1 h;模拟肠液为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间1 h;优选的半仿生提取法工艺在黄芪总多糖、提取收率、保护乙醇及吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤作用上均优于传统水提工艺;两种工艺得到的黄芪多糖为非均一多糖,分子量上存在差异。从形态学观察发现,半仿生提取醇沉黄芪多糖能预防乙醇及吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤,且有剂量关系。其对乙醇诱导胃粘膜损伤的保护作用机制是通过凋亡途径,即升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达,而发挥对胃粘膜损伤的保护作用。