广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.为唇形科多年生草本植物,其干燥地上部分入药,具有芳香化湿,和中止呕,发表解暑之功效,是广东道地药材之一。广藿香已被广泛应用于医药、香料及化妆品等领域,它是藿香正气口服液、藿香正气滴丸、霍胆丸等多种中成药的原材料,其挥发油还可作为化妆品、定香剂和杀虫剂等生活用品的生产配料。然而,由于城市化及经济效益低等原因,作为道地药材的“酮型”广藿香(“牌香”与传统“肇香”)已经鲜有种植,而如今广泛种植的“肇香”及其他品种的广藿香均为“醇型”广藿香,且不同产地之间存在相互引种的情况,可能会导致种质混乱的情况出现,难以从源头上保证广藿香的质量与产量。因此,对广藿香种质资源进行重新整理及评价具有重要意义,可为广藿香种质的有效保护及充分开发提供参考依据。(1)广藿香AFLP反应体系的优化及引物筛选本实验首先建立并优化广藿香扩增长度多态性(AFLP)反应体系,对酶切连接体系、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等关键因素进行考察,然后对AFLP引物组合(E/M组合)进行筛选,从225对引物组合中筛选出条带清晰,多态性丰富的引物组合。结果表明,最优体系如下:酶切体系为20μL,含300 ng模板DNA,在37℃下反应3 h;连接反应在16℃下反应12 h;连接产物的最适稀释倍数为3倍;预扩增产物的最适稀释倍数为20倍。采用优化好的反应体系筛选出了12对条带清晰、多态性丰富的引物组合。优化好的反应体系适用于广藿香AFLP分子标记研究,筛选出的引物也具有较好的多态性,可为后续的广藿香优良种质筛选提供技术支持。(2)基于AFLP分子标记的广藿香遗传多样性分析采用AFLP分子标记方法研究广藿香的种质遗传多样性及遗传结构。首先使用已筛选出来的12对引物对13个品种共203个样本进行AFLP分析;然后利用POPGENE32、Arlequin-ver3.5、MEGA7、NTSYSpc2.10e等生物学分析软件进行多态性参数计算、主坐标分析以及聚类分析。结果如下:12对引物共扩增出2238个位点,其中多态性位点有2226个,多态位点百分率为98.93%;在种群间,有效等位基因数(Ne)为1.3550±0.0624,Nei’s基因多样性指数(H)为0.2160±0.0349,Shannon多态性信息指数(I)为0.3375±0.0487;在种群内,有效等位基因数(Ne)为1.1147±0.0374,Nei’s基因多样性指数(H)为0.0692±0.0224,Shannon多态性信息指数(I)为0.1065±0.0345;分子方差学分析(AMOVA)表明广藿香的总变异有71.64%来源于种群间,28.36%来源于种群内;聚类分析可将13个种群分为4大类,其中芒头地、靖西、莲塘、龙洞聚为第Ⅰ类;印尼、四会、白沙聚为第Ⅱ类;法国单独聚为第Ⅲ类;其余的德庆、雷州、高州、禄步、广宁五个居群聚为第Ⅳ类。AFLP分子标记结果显示,广藿香种间具有比较丰富的遗传多样性,种内遗传多样性相对较小,种间遗传分化显著,可为广藿香后续的优良种质筛选等研究提供参考依据。(3)基于UHPLC-MS/MS的广藿香非靶标代谢组学研究采用UHPLC-MS/MS技术结合多元统计分析方法研究四个代表性广藿香品种(“南香”、“湛香”、“牌香”、非传统“肇香”)代谢产物的差异性,筛选出不同品种间的差异成分,为阐明不同品种间出现性状差异及化学成分差异的机制提供依据。结果显示,四个品种之间均存在显著性差异,其中德庆和石牌两个产地的广藿香相对比较接近,雷州和石牌、德庆两个产地的广藿香均有一定差异,海南与石牌、雷州、德庆三个产地的广藿香均相差比较远;每个比较组的差异代谢物大部分都分布在脂质及类脂质分子、有机杂环化合物、苯环型化合物、苯丙烷和聚酮类化合物、有机酸及其衍生物、有机氧化合物这六类,而每组分布在各类别的比例有所不同,还有少数差异代谢物分布在其他类别。对二级鉴定到的各比较组的差异代谢物进行Pathway分析,发现每个比较组的差异代谢物都是参与代谢途径的占最多。这些差异代谢物所参与的通路可能与不同品种广藿香之间存在性状差异甚至功效差异有所关联,其中的作用机制复杂,有待进一步研究。