【摘 要】
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抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一类具有抗病毒、抗真菌、抗细菌及抑制癌细胞生长等生物学功能的小肽,是一类重要的抗生素潜在替代品,其在生物医药、食品防腐及畜牧业绿色养殖等领域有着广泛应用。本课题以南海海洋沉积物为研究出发材料,构建了宏基因组文库;利用基于抗菌肽功能的筛选方法挖掘了具有产业应用价值的新型抗菌肽;之后应用氨基酸测序技术测析了其一级结构;随后利用基因工程技
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31772641）； 中国博上后科学基金项目（2017M611071）； 中国博士后科学基金特别资助项目（2018T110168）；
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抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一类具有抗病毒、抗真菌、抗细菌及抑制癌细胞生长等生物学功能的小肽,是一类重要的抗生素潜在替代品,其在生物医药、食品防腐及畜牧业绿色养殖等领域有着广泛应用。本课题以南海海洋沉积物为研究出发材料,构建了宏基因组文库;利用基于抗菌肽功能的筛选方法挖掘了具有产业应用价值的新型抗菌肽;之后应用氨基酸测序技术测析了其一级结构;随后利用基因工程技术和枯草芽孢杆菌表达系统优化出了新型抗菌肽的胞外表达体系。本文的主要结论是:1.应用宏基因组技术从南海海洋沉淀物中提取、纯化并获得了的宏基因组文库DNA。2.在南海海洋沉积物宏基因组文库DNA基础上,构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统的宏基因组文库。3.应用抗菌肽功能平板筛选从南海海洋沉淀物宏基因组文库中筛选出了产生抑菌圈的阳性克隆子,之后应用DNA测序技术获取新抗菌肽的碱基序列。4.对筛选得到抗菌肽进行了温度、酸碱度和酶的耐受性以及抑菌谱、抑菌效价等方面的生物学特性研究,获得了一个特殊生物学特性的抗菌肽,命名为Naseain 9。5.应用自动Edman降解测序技术测定出了 Naseain 9的氨基酸序列为VLTKKKPINTIYCGTVPCQGKKKRMGGLVKK,并应用生物信息学的方法预测了Naseain 9二级结构。6.基于新型抗菌肽Naseain 9结构,结合生物信息学和偏爱密码子方法,优化出适宜于在枯草芽孢杆菌宿主菌中表达的新型抗菌肽DNA序列GTTCTKACAAAAAAAAAACCGATTAATACAATTTATTGCGGCACAG TTCCGTGCCAAGGCAAAAAAAAAAGAATGGGCGGCCTKGTTAAA AAA。7.构建出了基于枯草芽孢杆菌表达系统组件最优组合的新型抗菌肽高效分泌表达体系BNAS,其在摇瓶水平下1 L发酵液上清中最高可获得89 mg的Naseain 9样品。
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