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目的胎儿宫内发育迟缓（IUGR），又称为胎儿生长受限（FGR），是围产期主要并发症之一，其发病率在不同国家与地区不尽一致，我国IUGR发生率为6.39-16.3％。IUGR儿由于机体胰岛素抵抗导致成年期代谢综合征（包括肥胖、高血压、冠心病、糖耐量异常和2型糖尿病等）的发病率明显增高。IUGR个体发生胰岛素抵抗的机制尚不清楚，目前认为孕期营养不良可能导致子代某些器官或组织的结构或功能发生永久性改变。Hales和Barker提出的“节俭表型假说”得到普遍赞同，该假说认为不良的子宫内环境引起胎儿胰岛B细胞数量减少或功能异常；为保证重要脏器如脑的发育，外周组织（肝脏、脂肪、骨骼肌等）的发育和代谢类型发生“永久性”改变，产生胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指机体内胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，它与胰岛素信号转导的各个环节、调控糖脂代谢的多种基因的分子异常和多态性相关。PI-3K途径是胰岛素代谢作用主要信号转导途径之一。胰岛素受体激活后，使胰岛素受体底物（IRS）磷酸化，磷酸化的IRS1／2激活PI-3K的p110亚单位，通过一系列级联反应活化PDK再激活蛋白激酶B（PKB），肝脏中PKBt激活后使糖原合成酶激酶（GSK）3丝氨酸残基磷酸化而失活，加速糖原正常合成。糖异生增加导致的肝葡萄糖输出增多是2型糖尿病机体胰岛素抵抗的重要组成部分。肝脏糖异生的关键调节因子是辅激活因子过氧化物酶体增殖因子活化受体γ的辅激活因子（PGC-1）α，PGC-1α对糖异生的调控主要发生在转录水平，可诱导肝细胞糖异生关键酶组，包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）和果糖1，6-二磷酸酶（FBPase），从而引起肝糖输出增加。蛋白质和氨基酸的缺乏是慢性营养不良的关键因素，我们采用孕期全程蛋白营养不良法建立大鼠IUGR模型，观察IUGR鼠的出生体重和不同发育阶段的体重、肾周脂肪重量和脏器重量，检测血清和肝脏中的糖原和游离脂肪酸的含量以及血糖和胰岛素水平，通过胰岛素耐量实验和基础状态法，了解母鼠孕期营养不良所致IUGR雄鼠在发育的不同阶段体内胰岛素敏感性的变化。检测肝脏中胰岛素信号传导和效应分子IRS-2、PI-3Kp110、PKB、GSK-3β等的蛋白表达和磷酸化水平，同时检测肝脏中转录激活因子PGC-1α的蛋白表达变化，糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的mRNA表达变化。通过比较各组成年子鼠肝脏胰岛素信号分子的变化，以及不同发育阶段肝脏糖异生酶差异，分析孕期低蛋白与机体胰岛素抵抗发生的关系，探讨IUGR儿成年后发生胰岛素抵抗的分子机制。实验方法一、动物模型的制备健康Wistar大鼠，体重230-280g，雌性均为处女鼠，大鼠按雌：雄4：1合笼。孕鼠按受孕顺序随机分成IUGR组和正常对照组，对照组孕鼠饲以标准饲料（热卡为1583KJ／100g，蛋白质含量为23％），IUGR组孕鼠自妊娠第1天饲以低蛋白饲料（热卡为1558KJ／100g，蛋白质含量为8％）。所有孕鼠自然分娩，称量12h内新生子鼠体重，精确到0.01g。IUGR诊断标准：新生鼠出生体重低于正常对照组出生平均体重的2个标准差的为IUGR鼠二、实验对象选择分娩后母乳喂养，两组母鼠都饲以标准饲料。IUGR组和正常对照组（CON）幼鼠满3周后断乳，分笼饲以标准饲料。1、幼鼠标本采集及处理满3周龄时每组随机选6只雄性子鼠禁食12h后采用摘眼球法取血，静置15min后，3000rpm离心10min，血清于-70℃保存。取血后立即处死，测量肝脏、肾脏、心脏、全脑重量，精确到0.001g，标本于-70℃保存。2、成年鼠标本采集及处理满8周龄后，IUGR组和正常对照组雄性子鼠各随机取6只空腹12小时后称量体重，由尾静脉取血，静置15min后，3000rpm离心10min，血清-70℃保存，取脑、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、和肾周脂肪标本并称重，精确到0．001g，标本于-70℃保存。3、成年鼠胰岛素耐量实验8周龄雄性子鼠每组随机选6只空腹12小时后称量体重，乌拉坦腹腔注射麻醉，分离右下肢股静脉插入18G套管针留置，腹腔注射胰岛素溶液0.5U／kg，在0min、15min、30min、60min每次抽取0.2ml血，血清-70℃冻存。三、实验方法1、测量新生鼠出生体重和1到8周不同发育阶段的体重，测量3周和8周子鼠的全脑、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、和肾周脂肪重量。2、生化方法检测3周和8周子鼠血清及肝脏中游离脂肪酸和糖原的含量。3、采用葡萄糖氧化酶法检测3周和8周子鼠空腹血糖浓度和胰岛素耐量实验中各个时间点的血糖值。4、采用ELISA方法检测3周和8周子鼠空腹血清胰岛素水平。5、PGC-1α、PEPCK和G6Pase表达的检测：采用Western杂交检测3周和8周子鼠肝脏组织中PGC-1α的蛋白表达，采用RT-PCR法检测PGC-1α、PEPCK和G6Pase的mRNA水平。6、PI-3K途径分子表达的检测：Western杂交检测8周子鼠肝脏组织胰岛素信号传导和效应分子IRS-2、PI-3K、PKB以及GSK-3β的蛋白表达，同时测定PKB在胰岛素刺激前后的磷酸化水平变化。实验结果一、孕期蛋白质缺乏对子鼠生长发育的影响IUGR组IUGR发生率明显高于正常对照组（P＜0.001），IUGR组子鼠的平均出生体重比对照组比低约40％（P＜0.001）。满4周时IUGR组平均体重达到对照组平均水平，8周时IUGR组体重超过正常对照组（P＜0.05）。3周龄IUGR组幼鼠器官重量虽然普遍略低于正常对照，但没有统计学意义，只有肾脏重量IUGR组与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05），8周时肾周脂肪重量IUGR组明显高于对照组（P＜0.01）。二、IUGR子鼠糖脂代谢和胰岛素敏感性的改变3周龄幼鼠的空腹血糖和胰岛素浓度以及IRI比较无明显差别。肝脏中FFA浓度和糖原含量两组之间差异也无统计学意义。8周IUGR子鼠空腹血清胰岛素浓度升高（P＜0.01），IRI比较有显著性差异（P＜0.05），肝脏FFA浓度和糖原含量差异无统计学意义，血清FFA浓度IUGR组高于对照组（P＜0.05）。胰岛素耐量实验中可见IUGR鼠对外源性胰岛素反应迟钝，胰岛素刺激15min后血糖较基础值仅降低25％，而对照组降低44％；2组在30min时血糖均降低至最低值，IUGR组血糖降低31％，对照组降低54％；60min时血糖己上升，IUGR组和对照组血糖较基础值降低分别是19％和34％。胰岛素刺激后IUGR组各个时间点血糖较基础值降低的幅度都明显低于对照组。三、IUGR子鼠肝脏PI-3K途径分子表达变化1、肝脏IRS-2、PI-3K和GSK-3β的蛋白表达变化Western blot检测结果显示，8周时IUGR组大鼠肝脏IRS-2的蛋白表达与正常对照没有差别（P=0.371）；PI-3K的催化亚单位p110的蛋白表达明显降低（P＜0.01）；而IUGR组大鼠肝脏中GSK-3β蛋白表达增加（P＜0.01）。2、肝脏PKB的蛋白表达及磷酸化水平的变化与对照组相比，在基础状态和胰岛素刺激状态下，8周IUGR组大鼠肝脏PKB蛋白和磷酸化的PKBSer473表达都明显降低（P＜0.01），胰岛素刺激状态下，对照组肝脏磷酸化的PKBSer473表达明显增加，是基础状态下的182％（P＜0.01），而IUGR组肝脏磷酸化的PKBSer473的增加不明显，仅是基础状态下的123％（P=0.024）。四、IUGR子鼠肝脏PGC-1α和糖异生酶表达的变化1、肝脏PGC-1α表达水平的变化RT-PCR结果显示，IUGR组3周幼鼠（P＜0.01）和8周成年鼠（P＜0.05）肝脏PGC-1α的mRNA相对表达量明显高于正常对照；Western blot结果也证实，在3周和8周，IUGR鼠肝脏中PGC-1α的蛋白水平都明显增加，分别是对照组的162％和230％（P＜0.05）。2、肝脏PEPCK和G6PasemRNA水平的改变采用RT-PCR技术检测发现，3周IUGR组肝脏PEPCK的mRNA的表达略高于正常对照（P＜0.05），8周时IUGR组的PEPCK相对表达量显著高于正常对照（P＜0.01）。无论幼鼠还是成年鼠，肝脏中G6Pase的mRNA表达水平，IUGR组都明显高于正常对照（P＜0.01）。而且PEPCK（r=0.907，P＜0.01）和G6Pase（r=0.726，P＜0.01）的mRNA水平与PGC-1的mRNA含量显示高度正相关。结论1、宫内蛋白营养不良可导致大鼠IUGR，IUGR子鼠生后出现生长追赶，成年后较正常同龄鼠肥胖，肾周脂肪沉积，出现糖脂代谢异常。2、IUGR子鼠幼年血糖和胰岛素水平与对照没有差异，成年后出现高胰岛素血症，IRI增高，胰岛素耐量实验证实IUGR鼠体内存在胰岛素抵抗。3、IUGR成年子鼠肝脏PI-3K蛋白表达降低，PKB的蛋白表达和磷酸化水平都降低，胰岛素刺激后表达增加的不明显，说明肝脏胰岛素信号通路PI-3K／PKB途径分子异常，对胰岛素反应敏感性降低。4、IUGR成年子鼠肝脏中PI-3K／PKB途径分子异常，导致GSK-3的表达增加，可能造成对肝脏糖原合成酶的抑制增强，促进肝葡萄糖输出，构成IUGR大鼠肝脏胰岛素抵抗的机制。5、肝脏中PKB的蛋白表达和磷酸化水平降低，引起IUGR鼠自幼年至成年肝脏中糖异生的关键调控因子PGC-1α的mRNA和蛋白表达增加，诱导糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的mRNA表达增加，促进糖异生，增加肝脏葡萄糖输出，促进高血糖的发生。