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黄精(Polygonatum sibiricum Red.)是百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)植物,其多年生干燥的根状茎是药食同源的中药材,性平,味甘,具有润肺健脾、滋阴益肾的效果,常用于治疗脾虚胃弱、肺劳咳血、糖尿病、高血脂症等。2015版《中国药典》收录的中药黄精的来源植物有黄精(P.sibiricum)、多花黄精(P.cyrtonema Hua)和滇黄精(p.kingianumColl.et Hemsl.)三种。研究显示,多糖为黄精的主要药用成分,具有提高机体免疫、降糖降脂、抗肿瘤、抑菌及抗病毒等功效。目前黄精以野生资源为主,随着黄精在医药、食品及工业等各领域的应用规模与日俱增,其野生资源被严重破坏并逐渐枯竭。致使诸如对叶黄精(P.punctatum)、热河黄精(P.maropodium)、长梗黄精(P.filpes)、卷叶黄精(P.cirrhifolium)等其他黄精属植物代替黄精入药的案例屡见不鲜。要解决黄精渐增的供需矛盾,大规模栽培是最切实可行的途径。黄精品种的特性是决定栽培黄精的产量与品质高低的关键因素之一。目前黄精以无性繁殖为主,持续多年的无性繁殖致使栽培黄精逐渐呈现出抗性、产量与品质均降低的状况,培育优良品种迫在眉睫。黄精在我国分布广泛,不同地域水肥、气候等条件差异巨大,种质变异显著。系统研究不同黄精种质资源,建立科学的种质资源评价体系,筛选出优良种质,为新品种选育提供优质材料具有重要的现实与理论意义。但目前尚缺乏这方面的系统研究。本课题在黄精种质资源收集、整理的基础上,筛选出区分不同黄精种质的表型性状,进而对筛选出的种质的多糖含量与组成、转录组及代谢组进行系统分析,筛选出黄精多糖合成通路相关基因中具有SSR位点的酶基因,构建了基于SSR标记的黄精DNA指纹图谱,最终建立了科学评价黄精种质资源的技术体系,并构建了相关核心种质的数据库。论文主要研究结果:1.收集、整理了我国陕西、甘肃、河南等11个省市19个种群的不同黄精种质314份。根据黄精的生物学属性,综合考虑相关性状并选择叶宽(LW)、叶形指数(LSI)、叶轮数(LRN)、总花梗长(TPL)、总花数(TNF)、种子数目(SN)、根长(RL)、根状茎鲜重(RFW)等22个表现型性状指标进行统计分析,发现根数(变异系数29.92%)、叶轮数(22.54%)、叶形指数(18.76%)、叶宽(16.22%)、总花梗长(14.74%)、总花数(14.23%)、种子数目(14.02%)这几个特征指标遗传稳定且变异较大,适合区分种质差异。根据表型性状间欧式距离进行UPGMA聚类分析,共聚为4类,表现出一定的地域性和不连续性。表型性状与生态因子相关分析发现,经度越大,花梗长度越长;纬度越高叶子越宽,根状茎长度越长:≥10℃积温越高,总花数越多,根系生长越好,当年生根状茎直径越粗;年降水越少,年均相对湿度越低,年均气温越低,≥10℃积温越小,根状茎长度越长,反之,根状茎长度越短。这与黄精野生分布于土壤阴湿且利水的山坡相符合,也为人工栽培黄精时选择沙质土和起垄种植的方法提供了理论依据。相关性分析结果显示:发现叶子(LW)越宽,则叶型指数(LSI)越小,当年生根状茎长度(CRL)越长;叶轮数(LRN)越多,则根状茎鲜重(RFW)越重,株高(PH)越高;总花梗长(TPL)越长,则根状茎鲜重(RFW)越重;总花数(TNF)越多,当年生根状茎直径(CRD)越粗。即叶宽(LW)、叶轮数(LRN)、总花梗长(TPL)、总花数(TNF)这四个表型性状指标对黄精优良种质的选择及新品种选育工作具有重要的指导意义。2.根据所筛选四个表型性状特征指标及Q型聚类的结果,筛选出13种黄精种质,另加4种多花黄精及滇黄精种质作对照,比较不同种质黄精粗多糖含量,发现含量差异极显著,其中陕西略阳(SXLY)的多糖含量为13.33%,河南洛阳(HNLY)的多糖含量为6.37%。黄精不同种质粗多糖均由阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖与半乳糖组成,但摩尔比均各不相同。阿拉伯糖所占比例最低,甘露糖所占比例最高,葡萄糖和半乳糖居中。当阿拉伯糖占比为1,甘露糖占比<18,葡萄糖占比<3,半乳糖占比<2.4时,该黄精种质的多糖含量较高;当阿拉伯糖占比为1,甘露糖占比>19.5,葡萄糖占比>3.2,半乳糖占比<2.6时,该黄精种质的多糖含量较低。黄精、滇黄精、多花黄精这三种列入《中国药典》的不同基源的药材,在单糖组成上差异很大。对SXLY的黄精种质的多糖提取纯化后,进一步分析了其主要物理性质。3.综合考虑叶宽、叶轮数、总花梗长和总花数这四个关键指标,采用比重加权的方法,最终选择 SXLY-107～128、SXFP-129～142、SXLB-073～086 和HNLY-001～016种质进行代谢组及转录组的相关研究。基于UPLC-Q-TOF/MS/MS技术的分析结果显示,不同黄精种质区分度较少,而不同基源的3种黄精间次生代谢物差异明显。通过偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)和s-plot分析表明黄精种间差异大于种内差异。通过二级质谱共鉴定到25种标志性差异代谢物。化合物KEGG注释分析结果显示,淀粉和蔗糖代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,半乳糖代谢和-丙氨酸代谢这四条代谢通路差异显著。热图分析、代谢物箱式图分析与Z-score分析均表明,既能区分不同种又能区分不同黄精种质的标志性差异代谢物为腺苷、蔗糖和焦谷氨酸。4.对多糖含量差异最大的两个种质(SXLY和HNLY)进行转录组测序,其中13,839条Unigenes注释到128条代谢通路中,其中1,860条Unigenes与糖类物质代谢相关,与黄精多糖生物合成相关的酶基因共有20种(138条Unigenes),两种质间显著差异的关键酶基因有sacA(编码β-呋喃果糖苷酶),GALE(编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶),CGDH(编码UDP-葡萄糖-6-脱氢酶),UXE(编码UDP-阿拉伯糖4-差向异构酶),RHM(编码UDP-葡萄糖4,6-脱水酶),scrK(编码果糖激酶),GMPP(编码甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶)和HK(编码己糖激酶)八种(88条Unigenes)。通过GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析筛选出最适合黄精的内参基因是TUB。qRT-PCR检测分析上述8种关键酶基因在不同种质中的表达水平,发现多糖含量与sacA,scrK,GALE,GMPP和UGDH的表达模式呈正相关,但与HK的表达呈负相关,说明这几种基因的表达量亦可用于区分不同的黄精种质资源。结合糖组成、含量的结果综合分析,发现黄精多糖合成途径中的关键酶基因是sac,HK和GMPP,这有助于从分子水平上理解黄精多糖的生物合成,也为从分子鉴别种质差异奠定了基础。5.在黄精转录组测序分析的基础上,筛选出黄精多糖合成途径中的具有SSR位点的酶基因并开发引物,利用筛选的12对核心引物构建了 32种黄精材料DNA指纹图谱,既包括不同黄精种质的材料,也包括多花黄精和滇黄精材料,发现每种材料的指纹图谱具有唯一性,通过聚类和PCA分析能精准的反映不同黄精品种(系)的亲缘关系。多糖含量越接近聚类关系越近,差异越大则越远,且所有的黄精种质、多花黄精种质以及滇黄精种质分别聚集在一起。最终形成了包含品种名称,类型,植物学分类,种质来源,气候情况,指纹图谱代码等情况的指纹图谱QR编码,研究结果可为优良品种选育、优良种质鉴定等相关工作提供服务。即本论文以种质资源为基础,多糖研究为主线,差异代谢研究为辅线,建立了一整套科学的评价黄精种质优劣的方法体系。