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哺乳动物卵巢中卵泡闭锁现象是非常普遍的,在卵泡发育过程中,绝大部分卵泡(75%-99%)发生退化现象,只有极少数卵泡能成熟排卵。随着人们对细胞凋亡研究的探索,逐渐明白到颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的主要原因。近些年来,人们已经发现了许多抑制或促进卵泡闭锁的因素,但是,调控卵泡闭锁的分子机制还未完全阐明,今后仍需要做进一步的研究。研究卵泡发育和闭锁对于人类而言,将为治疗不孕、提高妊娠率有一定的指导意义；对于提高动物繁殖力和胚胎工程发展也有着十分重要的意义。随着人们对nicroRNA(miRNA)的研究,人们发现miRNA是一大类非编码的、有重要调控作用的、功能性RNA家族。miRNA广泛分布于各种真核生物中,参与机体细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、物质代谢、肿瘤发生与抑制和细胞信号转导等各项生命活动。已有研究证实,在猪卵泡闭锁过程中,有一些miRNA的表达量是显著上调的并且对猪卵巢颗粒细胞的凋亡有促进作用。因此,本文将对miRNA与颗粒细胞的凋亡关系展开研究,以进一步阐明调控卵泡闭锁的分子机制。本研究试验选取猪卵巢颗粒细胞为主要研究对象,基于本课题组研究的基础和国内外文献资料报道,选取miR-26b和miR-34a做为研究卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的调控因子。通过生物信息学网站预测靶基因,结合靶基因的功能选取HAS2和INHBB做为候选靶基因,在HeLa229细胞中,我们利用双荧光素酶报告系统和定点突变试验去验证主效靶基因,然后,转染猪颗粒细胞,利用Real-time PCR技术、流式细胞术和Western Blotting技术检测miR-26b和miR-34a对猪卵巢颗粒细胞的作用以及与其靶基因的调控形式,进一步以阐明对猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的调控机制。全文结果如下：(1) RT-PCR发现靶基因HAS2在猪卵巢和颗粒细胞中表达；通过双萤光素酶报告系统和定点突变实验发现,HAS2基因是miR-26b的直接靶基因；Real-time PCR发现转染miR-26b的颗粒细胞发生凋亡；流式细胞仪检测发现miR-26b促进颗粒细胞的凋亡,miR-26b inhibitor能抑制内源性的miR-26b对颗粒细胞的凋亡作用；利用Real-time PCR和Western Blotting技术证实了miR-26b在转录后水平调节靶基因HAS2的表达。(2)在猪卵母细胞体外成熟培养过程中,Real-time PCR检测Oh、12h、24h、36h和44h五个时间点的HAS2表达量发现,其mRNA的表达量显著上升,由此可以推测在卵母细胞成熟过程中,HAS2对卵丘的扩张发挥着十分重要的作用。(3) RT-PCR发现靶基因INHBB在猪卵巢和颗粒细胞中表达；通过双萤光素酶报告系统和定点突变实验发现,INHBB基因是]niR-26b的直接靶基因；利用Real-time PCR和Western Blotting技术证实了miR-26b在转录后水平抑制靶基因INHBB的表达。(4)通过双萤光素酶报告系统和定点突变实验发现,INHBB基因是miR-34a的直接靶基因；Real-time PCR发现转染miR-34a的颗粒细胞发生凋亡；流式细胞仪检测发现miR-34a促进颗粒细胞的凋亡,miR-34a inhibitor能抑制内源性的miR-34a对颗粒细胞的凋亡作用；利用Real-time PCR和Western Blotting技术证实了miR-34a在转录后水平抑制靶基因INHBB的表达。本文证实了HAS2和INHBB基因是miR-26b的靶基因,INHBB基因也是miR-34a的靶基因,miR-34a对靶基因INHBB的调节能力更强；miR-26b和miR-34a都是在转录后水平抑制靶基因的表达,并且促进颗粒细胞的凋亡。从而探索了miRNA促进猪颗粒细胞凋亡的分子机制,这是对：niRNA功能在卵泡闭锁过程中作用的进一步扩展,有助于今后人们深入研究卵泡闭锁分子调控机理。