古紫质-4(Archaerhodopsin-4,aR4)是嗜盐菌xz515细胞膜上以视黄醛为发色团的七-跨膜光敏受体蛋白,具有与细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)类似的光驱质子泵功能。然而作为一个类bR蛋白,aR4却表现出了不同的质子传输时序,其中保守性芳香性氨基酸的作用极为引人注目。位于bR视黄醛发色团键合区的酪氨酸185(Y185)不仅作为希夫碱(SB)的平衡离子参与其氢键网络的形成、辅助发生在希夫碱和天冬氨酸85(D85)间的第一步质子传输,而且很可能是bR光循环中的一个微开关,调控着视黄醛的顺反异构平衡比例以及能量转化效率。因此,位于aR4中相同位置的酪氨酸186(Y186)的作用自然就成了研究aR4质子泵功能和能量转化机制的一个热点。本论文瞄准这一热点课题,选用嗜盐菌L33为宿主细胞实现了野生型aR4蛋白的重组表达RCL33-aR4(recombinant aR4),并利用重叠延伸PCR技术成功构建了 Y186FL33-aR4突变体。采用固体核磁共振、红外光谱、紫外-可见光谱、动力学瞬态吸收光谱等技术手段,并辅以滴定分析以及ATP生成率测定等,对aR4中的Y186的作用进行了初步探究。通过与bR中Y185的功能对比,本论文深入探讨了 aR4中Y186对其视黄醛发色团、光循环以及ATP生成率调控作用的分子机制。研究表明,相对于RCL33-aR4,Y186FL33-aR4突变体的紫外-可见光谱最大吸收峰发生了 4 nm的蓝移,这与Y185F突变对bR紫外-可见光吸收造成的影响基本一致。动力学行为测定结果表明,Y186FL33-aR4突变体的M中间态寿命延长了约为野生型的5倍,O中间态寿命延长了约2倍,同时突变之后造成了质子泵功能的明显减弱。虽然bR中Y185F突变同样造成了 M中间态寿命的延长以及质子泵功能的减弱,但同时也造成了 O中间态的消失。通过四标记视黄醛蛋白样品的核磁共振和光循环中间态的红外光谱研究,可以得出Y185/Y186对bR和aR4中的视黄醛发色团的调制作用不同,进而可以推测二者光循环确有差异。此外,相对于重组RCL33-aR4菌株,Y186FL33-aR4突变造成了蛋白聚集状态的改变以及菌株ATP生成率约36.5%的降低。因此可以判定,位于视黄醛键合区的Y186是一个对质子传输和能量转换起着重要作用的芳香性残基。