无论战时还是平时,火器性周围神经损伤都较为常见,且呈增加趋势。虽然近年来在神经再生修复方面取得了一些进展,但是因其修复效果并不理想,尤其是火器性周围神经损伤后,其再生修复效果更差。因而火器性周围神经损伤的修复仍是困扰骨科医生的一大难题。近年来的研究显示,周围神经损伤后,相应中枢神经元发生程度不同的凋亡与神经再生修复困难关系密切。而目前国内外对火器性周围神经损伤后,相应中枢神经元的凋亡特点的研究报道尚很少。 凋亡的发生是一个复杂的过程,来自细胞内外的死亡信号均可启动凋亡程序,而在这一过程中起核心作用的是由caspases家族组成的蛋白水解酶系统,其可以水解多种底物,包括DNA断裂因子(DNA fragmentation effecter,DFF)。DFF广泛存在于各种细胞之中,在正常情况下由分子量分别为45KD(即DFF45)和40KD(即DFF40)两个亚单位伴随结合在一起,并不具有生物学活性;但是caspases可以降解DFF45,使DFF40与DFF45两亚单位解聚,脱离出来的DFF40即活化成为DNA酶(DNase),该酶可引起DNA裂解和染色质凝聚,进而产生凋亡小体,引起细胞凋亡。 CIDE(Cell death—inducing DFF45-like effector,CIDE)即:诱导细胞死亡DFF45样的效应因子,是新近发现的一个与细胞凋亡密切相关的一个基因,参与凋亡的信号执行过程。它包括CIDE.A、CIDE.B和CIDE.3,它们的N.端与DFF40、DFF45的N-端有高度同源性。其中,CIDE-B可通过N-端结合DFF45和DFF40,但其与DFF45结合能力强于DFF40的结合。这样CIDE-B与DFF45结合,进而使DFF两个亚单位分离,DFF40活化,引起细胞凋亡。因而CIDE-B成为诱导细胞凋亡发生发展的关键环节之一。 由于神经元是高度分化的细胞,胞体不具有再生能力,若神经元发生凋亡,则使周围神经轴突丧失再生的物质基础。因而如何减少神经元的凋亡并保护神经元,将对周围神经的再生修复具有重要的意义。 对神经元保护,以往多集中在神经营养因子上,包括采用神经生长因子载体的基 本课题受国家973项目(G1999054206)科研基金资助<WP=13>因治疗方法等。而凋亡相关基因是神经元发生凋亡的内在原因,CIDE-B作为凋亡过程中关键环节蛋白,采用基因治疗的方法来抑制和调节其基因表达,以达到保护神经元目的的研究,目前国内外尚未有文献报道。 本实验室在以往的研究中发现,火器性兔周围神经损伤后,通过基因芯片筛选与对照组相应中枢神经元的差异表达基因,发现伤后早期两组差异表达最明显的凋亡相关基因即为CIDE-B,伤后其表达比损伤前增强6.25倍。因而我们推猜在周围神经损伤后,CIDE-B在相应中枢神经元凋亡的发生中起着关键的作用。然而,迄今为止,尚未有任何文献报道CIDE-B在周围神经损伤后其变化的特点,及其在神经元凋亡中的作用。鉴于此,为进一步明确CIDE-B在火器性周围神经损伤中的作用,及CIDE-B对神经元凋亡的影响,本实验拟从以下三方面进行研究。 1.火器性坐骨神经损伤后神经元凋亡的特点 探讨在火器性与切割性坐骨神经损伤两种不同致伤条件下,相应中枢神经元发生凋亡的不同特点,为对火器性周围神经损伤寻求一种新的治疗途径或思路。 2.不同损伤条件下CIDE.B的变化与神经元凋亡的关系初步探讨上述两种不同致伤条件下对CIDE-B表达的影响,及其与神经元凋亡之间的关系。 3.CIDE-B的变化对神经元凋亡调控的体外研究体外培养大鼠脊髓神经元,通过反义核酸技术干预CIDE-B的表达,了解其对相应神经元凋亡的影响。 方法: 1.建立兔火器性坐骨神经损伤模型。以三角形弹片为致伤物,造成兔坐骨神经震荡伤及断裂伤模型,并比较其与兔坐骨神经切割伤后,神经元凋亡的不同。 2.提取脊髓总RNA,采用RT-PCR的方法检测CIDE-B的表达变化趋势。 3.采用原位杂交的方法分析脊髓神经元内CIDE-B的分布特征,变化规律。 4.提取脊髓总蛋白质,采用Western blot方法研究CIDE-B蛋白的变化规律,揭示神经元凋亡与CIDE-B之间的内在联系。 5.建立原代脊髓神经元培养模型,采用机械损伤的方法诱导神经元的凋亡。设计合成CIDE-B反义核酸,转染导入神经元内,抑制CIDE-B mRNA的转录和翻译,通过流式细胞仪检测观察CIDE-B对神经元凋亡的影响。 结果: 1.火器性坐骨神经断裂伤后,兔脊髓神经元发生明显的凋亡。伤后6小时后开始出现,ld、3d增加,7d达到凋亡高峰,持续到伤后2w开始下降,4w明显减少。神经切割伤组凋亡的时间出现较晚,数量较少。 <WP=14>2.火器性损伤神经损伤后,脊髓前角神经元的数量减少,2w、4w减少约17.7%,51.4%;切割伤组,伤后2w、4w时,脊髓前角神经元减少8.4%,15.4%。 3.脊髓内CIDE-B的表达在神经损伤后,CIDE-B mRNA表达增强。火器性损伤组,增加的幅度较大,第1d开始增加,7d到达峰值,持续到2w,4w回落;切割伤组增加延迟,幅度也小。蛋白水平的变化与此相一致。 4.脊髓原代神经元培养,经过。NF200kDa抗体鉴定,纯度约为80%。采用划痕法机械损伤诱导神经元凋亡,损伤后3d约30%神经元发生凋亡。 5.体外神经元培养凋亡模型下,转染CIDE-B反义寡核酸,神经元凋亡数量下降了15%,凋亡的数量明显减少,抗凋亡有效率约20%。而随