论文部分内容阅读
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的严重危害全球养猪业的重大传染病。病毒基因组是大小约12,3 kt的单股正链RNA,基于E2基因核苷酸序列的遗传衍化分析将全球的猪瘟病毒分为3个基因型（1、2和3）和11个基因亚型（1.11.4;2.12.3;3.13.4）。家猪和野猪是猪瘟病毒的唯一易感宿主,猪瘟感染通常表现发病急、持续高热、死亡率高等典型特征,但近年来,感染猪多表现出慢性、持续性感染、病程延长、死亡率低等非典型的猪瘟特点,临床实践中很难对此做出准确诊断。非典型猪瘟或持续感染的猪瘟可终身带毒、排毒,是猪瘟传播的重要传染源,严重威胁猪群健康,在健康猪群中准确鉴别并淘汰猪瘟持续性感染的猪只是猪瘟净化的关键所在和技术难点:在猪瘟感染过程中诱导机体产生中和抗体,但由于我国广泛使用猪瘟兔化弱毒株进行免疫,利用常规猪瘟抗体检测方法无法鉴别猪瘟流行毒株感染,而且目前国内外还没有能够鉴别猪瘟兔化弱毒株免疫和猪瘟流行毒株感染的血清学快速检测试剂盒,因此猪瘟持续性感染或隐性感染的血清学快速鉴别诊断对实现我国猪瘟净化至关重要。本研究以分析猪瘟病毒中国分离株和疫苗株的抗原性差异为出发点探究猪瘟持续性感染或隐性感染的血清学快速鉴别诊断方法的建立,并制备了4株抗猪瘟病毒的特异性单抗。为进一步验证这些单抗与猪瘟兔化弱毒株、猪瘟流行毒株以及牛病毒性腹泻病毒的反应性,本研究实验将本实验室保存的110株猪瘟病毒和3株牛病毒性腹泻病毒1型分别接种细胞进行IFA验证;同时利用杆状病毒表达系统成功表达了猪瘟兔化弱毒疫苗株、猪瘟石门毒株、8个基因亚型（2.2、2.3、1.21.4、3.1、3.2和3.4）以及7个基因2.1亚亚型（2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i和2.1j）代表毒株的Erns蛋白和E2蛋白,用不含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液处理后,以1、3、4号单抗（抗E2蛋白）和2号单抗(抗Erns蛋白)为一抗进行Western blot分析。IFA结果显示,1号单抗不与猪瘟兔化弱毒株反应,能与猪瘟病毒石门株、2株基因1.1亚型流行毒株、全部的基因2.1a（共8株）、2.1g亚亚型（共2株）、2.1i（共1株）、2.1j（共1株）亚亚型毒株以及18株基因2.1b亚亚型（共19株）、16株基因2.1c亚亚型（共18株）、18株基因2.2亚型（共23株）和3株基因2.3亚型（共14株）的猪瘟病毒反应;2号单抗只与猪瘟兔化弱毒株发生强反应,与XD-1-5和XD-1-6两株基因1.1亚型分离株发生非常微弱的反应,与其他毒株均不发生反应;3号单抗能够与全部的基因1.1亚型毒株（共5株）、1株基因2.1c亚亚型毒株（共18株）以及6株基因2.2亚型毒株（共23株）发生反应,与其他毒株均不发生反应;4号单抗能够与全部的基因1.1亚型毒株（共5株）、基因2.1i和2.1j亚亚型（各1株）以及1株基因2.1a亚亚型毒株（共8株）、16株基因2.1b亚亚型毒株（共19株）、2株基因2.1c亚亚型毒株（共18株）3株基因2.1h亚亚型毒株（共19株）、20株基因2.2亚型毒株（共23株）和12株基因2.3亚型毒株（共14株）反应。同时这4株单抗与牛病毒性腹泻病毒1型没有交叉反应。Western blot结果与IFA结果一致:1号单抗与基因1.2、1.3、1.4和3.1亚型毒株的E2蛋白反应,与基因3.2和3.4亚型毒株的E2蛋白不反应;2号单抗与3号单抗与基因1.21.4、3.1、3.2和3.4亚型毒株的Erns蛋白和E2蛋白均不反应;而4号单抗与基因1.21.4、3.1、3.2和3.4亚型毒株的和E2蛋白均可反应。为明确单抗所识别的抗原表位类型,本研究用含有β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液处理杆状病毒系统表达或原核表达的猪瘟兔化弱毒疫苗株Erns蛋白和猪瘟病毒石门株E2蛋白以还原蛋白中的二硫键,并以正常状态的蛋白做对照进行Western blot分析,结果发现14号单抗只与真核表达的且未经二硫键还原处理的蛋白反应,表明14号单抗均识别构象抗原表位。本研究对4株猪瘟单抗同猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的反应性及其所识别抗原的类型进行了充分验证,这些单抗反映了猪瘟病毒株之间存在抗原差异,为猪瘟病毒抗原变异分析提供了手段;同时本研究获得了能区分猪瘟流行毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株的鉴别单抗,为鉴别猪瘟持续感染提供了重要的抗体试剂,对开创我国猪瘟的科学防控与净化新思路具有重要启发作用。