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研究目的:白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。白血病细胞因增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积,并浸润其他组织和器官,同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。近年来,白血病发病率呈逐渐升高趋势,居年轻人恶性疾病首位[1],儿童中最常见的是急型淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）,病理表现为异常分化的淋巴细胞在骨髓聚集,抑制正常血细胞的产生[2]。目前临床上在骨髓移植、传统联合化疗等技术的基础上,应用药物靶向治疗、细胞免疫治疗等技术,显著改善了ALL的治疗效果[3],但易复发、耐药性等仍为治疗难题。因此,探索急性淋巴细胞白血病的发病机制,寻找与预后相关的分子标记,以提升治愈率和改善预后,一直是白血病研究的重要课题。环状RNA（Circular RNA,circ RNA）是区别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA,其闭合环状结构可逃逸RNA酶的降解,比线性RNA更稳定。circ RNA可作为mi RNA海绵[3]、RNA结合蛋白[4]和转录翻译调节因子影响基因表达调控,在癌症发展、转移和治疗反应中发挥着重要作用[5]。circ RNA在序列上具有物种保守性,表达模式上具组织特异性和时序特异性,结构上具有高度稳定性,因此具有成为疾病分子标记的潜能[2]。然而,circ RNA在急性B淋巴细胞白血病诊断治疗中功能作用的研究不多。本课题组前期运用高通量测序技术检测急性B淋巴细胞白血病细胞（Ball-1）和人B淋巴母细胞（HMy2.CIR）两个细胞系circ RNA表达谱,筛选出在Ball-1中差异表达的hsa＿circ＿0097878,本研究通过实验验证hsa＿circ＿0097878与白血病的相关性,深入探索hsa＿circ＿0097878发挥mi RNA海绵作用,通过竞争性内源性RNA机制参与白血病发生发展的作用机制,寻找关键分子标志物,为白血病的有效诊断及治疗提供理论依据。研究方法:一、hsa＿circ＿0097878与白血病相关性分析1、实时荧光定量PCR技术检测hsa＿circ＿0097878在白血病细胞系及临床样本中表达丰度及环状特性。细胞转染技术构建hsa＿circ＿0097878过表达细胞系,应用CCK-8和流式细胞术分别检测hsa＿circ＿0097878对Ball-1细胞增殖、细胞凋亡的影响。2、应用RNA-seq方法检测Ball-1细胞系过表达hsa＿circ＿0097878前后的基因表达谱,利用GO和KEGG等生物信息学软件分析hsa＿circ＿0097878的生物学功能及作用机制。二、hsa＿circ＿0097878通过mi R-6773-3p调控IL4R和CD27表达参与急性淋巴细胞白血病发病机制1、生物信息学分析和核质分离实验验证hsa＿circ＿0097878亚细胞定位。2、利用生物信息学软件预测hsa＿circ＿0097878相互结合的mi RNA及其下游靶基因。构建hsa＿circ＿0097878-mi RNA-m RNA调控网络。利用GEO公共数据库选择两个与急性B淋巴细胞白血病临床数据相关的数据集,进行差异基因分析,构建蛋白-蛋白互作网络,筛选Hub基因,与hsa＿circ＿0097878 ce RNA网络基因相关性分析,确定ce RNA网络中的关键基因。3、对hsa＿circ＿0097878 ce RNA网络中的关键基因mi R-6773-3p及其靶基因CD27、IL4R的调控机制进行验证。转染mi R-6773-3p mimics或mi R-6773-3p inhibitor后,应用双荧光素酶报告基因、RT-q PCR、ELISA、Western Blot实验方法,验证hsa＿circ＿0097878与mi R-6773-3p以及mi R-6773-3p与CD27、IL4R互作位点以及调控作用的分子机制。应用CCK-8和流式细胞术检测mi R-6773-3p对Ball-1细胞增殖和凋亡的影响。结果:一、hsa＿circ＿0097878与白血病具有相关性1、在白血病患者以及白血病细胞系中hsa＿circ＿0097878的表达水平显著降低,在Ball-1细胞系中几乎不表达。过表达hsa＿circ＿0097878可以促进Ball-1细胞凋亡,抑制细胞增殖。2、构建Ball-1细胞系过表达hsa＿circ＿0097878前后RNA差异基因表达谱,发现434个差异表达基因（P-value<0.05,|log2FC|≥1.5）,其中上调259个,下调175个。在GO分析中,差异表达基因主要富集于免疫系统、信号转导以及信号分子相互作用等相关途径。KEGG富集分析表明hsa＿circ＿0097878参与NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路等调控机制。二、hsa＿circ＿0097878通过mi R-6773-3p调控IL4R和CD27表达参与急性淋巴细胞白血病发病机制1、应用mi Randa和PITA软件共同预测与hsa＿circ＿0097878相互作用的mi RNA,选择评分最高的5个mi RNA。用Target Scan和mi RDB两种软件共同预测mi RNA靶基因,得到重叠靶基因1083个。1083个靶基因跟过表达hsa＿circ＿0097878前后Ball-1细胞系的RNA-seq得到的差异表达基因进行筛选,得到共同靶基因15个m RNAs。构建5个mi RNA、15个m RNA的hsa＿circ＿0097878-mi RNAs-m RNAs调控网络。2、筛选ce RNA网络中与B-ALL发病机制密切相关的基因。在GEO数据库选择具有B-ALL临床数据资源的数据集GSE76349和GSE34861,将两个数据集共有差异基因与过表达hsa＿circ＿0097878前后RNA测序表达谱的差异基因,以及预测的靶m RNA三个结果进行韦恩分析,最终得到共有基因IL4R。IL4R是mi R-6773-3p的靶基因。通过对mi R6773-3p靶基因编码蛋白互作网络功能分析,筛选与增殖凋亡相关基因,确定IL4R与CD27为ce RNA网络中与B-ALL发病机制相关的关键基因。3、hsa＿circ＿0097878主要定位在细胞质中。生信分析和双荧光素酶报告基因验证mi R-6773-3p和hsa＿circ＿0097878相互作用,IL4R、CD27是mi R-6773-3p的直接靶点。mi R-6773-3p具有正向调控Ball-1细胞增殖,负向调控细胞凋亡的作用。补救实验证实hsa＿circ＿0097878影响Ball-1细胞增殖和凋亡的生物学功能是通过靶向调控mi R-6773-3p的作用实现的。4、白血病细胞中mi R-6773-3p负向调控IL4R、CD27的表达。IL4R、CD27在白血病细胞中受hsa＿circ＿0097878的正调控,补救实验证实mi R-6773-3p可以逆转hsa＿circ＿0097878对IL4R、CD27的表达变化。hsa＿circ＿0097878对IL4R、CD27的调控作用是通过mi R-6773-3p介导实现的。结论:1、hsa＿circ＿0097878在白血病细胞系和白血病患者临床样本中显著低表达,过表达hsa＿circ＿0097878可以促进Ball-1细胞凋亡,抑制细胞增殖,表明hsa＿circ＿0097878与白血病具有相关性,可能是白血病发生发展中一个重要的生物调控靶点。2、hsa＿circ＿0097878在白血病细胞中通过与mi R-6773-3p海绵吸附作用,调控IL4R、CD27的表达,进而调控白血病细胞增殖和凋亡的生物学特性而参与急性淋巴细胞白血病发病机制。